富硒酵母的分離鑒定及富硒條件的優化

蔡 飛，高飛飛，王 斌，史學偉，肖 婧*

（1.武威職業學院，甘肅 武威 733000；2.石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000；3.石河子大學 信息科學與技術學院，新疆 石河子 832000）

硒作為人體必需的微量元素，具有抗癌、抗氧化、增強人體免疫力等重要的生理功能及廣泛的藥理作用[1]。1817年，硒元素被發現是人體生命不可缺少的微量元素之一[2]。在此之前，硒元素被認為是種有毒有害物質。1957年，SCHARTZ K等[3]應用硒元素成功治療動物肝壞死疾病。1973年，世界衛生組織（world health organization，WHO）正式宣布：硒是人體生理必需的微量元素[4]。從此，硒元素逐漸的被認為是人和動物不可或缺的微量元素之一，成為了科學研究中的熱門元素，被稱之為“抗癌之王”、“心臟守護神”[5-6]。人體攝入硒的途徑有食物、水、空氣，而通過食物攝入是主要的途徑。然而，將無機硒直接添加于食品對人體有毒副作用，天然食品中硒含量普遍較低，僅靠天然食物中的硒并不能滿足人體的正常需要。研究表明，在富硒的環境中，硒元素能夠與酵母菌體內的蛋白質或多糖有機結合，形成硒蛋白或硒多糖，大大降低無機硒的毒副作用[7]。研究表明[8-9]，富硒酵母是最安全、最有效、最能維持營養平衡的補硒方式，目前，國外報道的富硒酵母中硒含量高達1 400 μg/g，國內報道的富硒酵母一般是將普通的釀酒酵母或稍做篩選的酵母在添加有適量亞硒酸鈉的發酵培養基中，于一定的培養條件下獲得，細胞含硒量在300～1 200 μg/g。本研究采用平板復篩法篩選高富硒量的酵母菌，對其進行形態學觀察及分子生物學鑒定，并采用單因素及正交試驗優化其富硒條件，對開發新富硒產品，解決人體硒元素缺乏問題具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

60株酵母菌：石河子大學食品學院發酵實驗室保藏菌株。

1.1.2 試劑

葡萄糖、酵母浸粉、瓊脂粉、蛋白胨、丙三醇、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、ddH2O：北京奧博星生物技術有限責任公司；亞硒酸鈉、甲酸、硝酸、高氯酸、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraaceticacid-2Na，EDTA-2Na）、EasyTaqSuper Mix：天津市致遠化學試劑有限公司；Gold view核酸染料：北京全式金生物技術有限公司。以上試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）：20 g葡萄糖，20 g蛋白胨，10 g酵母浸粉，1 L蒸餾水，自然pH，121℃高壓滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基：20 g葡萄糖，20 g蛋白胨，10 g酵母浸粉，20 g瓊脂，1 L蒸餾水，自然pH，121 ℃高壓滅菌20 min。

富硒培養基[10]：20g葡萄糖，20g蛋白胨，10 g酵母浸粉，10mg亞硒酸鈉，1L蒸餾水，自然pH，121℃高壓滅菌20min。

1.2 儀器與設備

5810R高速冷凍離心機：德國Eppendorf儀器公司；TC-512聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：英國Techne公司；Power Pac Universal電泳儀、Gel DOC XR凝膠成像系統：美國Bio Rad公司；CX21FS1光學顯微鏡：日本Olympus公司；LAC-5040S全自動高壓滅菌鍋：浙江新豐醫療器械有限公司；Bnp-9272智能生化培養箱、722紫外分光光度計：上海精宏試驗設備有限公司；LGJ-10冷凍干燥機：北京松源華興科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將60株酵母菌分別接入100 mL YEPD培養基中，置于28℃恒溫培養箱中，培養24～48 h。

1.3.2 菌株的分離純化

將活化菌液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4濃度梯度，分別吸取200 μL涂布于富硒培養基，每個濃度做3個平行涂布，置于28℃恒溫培養箱中培養24～48 h。經3次劃線純化得到單菌落，置于-20℃冰箱中保藏備用。

1.3.3 酵母菌的形態特征分類

依據《酵母菌的特征與鑒定手冊》[11]以及《微生物學》[12]對酵母菌株進行分類鑒定。

1.3.4 酵母菌株分子生物學鑒定

（1）DNA的提取[13]

向無菌EP管加入TE緩沖溶液50μL。吸取1mL液體培養物，加入EP管，混勻后，TE緩沖液洗滌3次，12000r/min離心5min。加入200μLTE緩沖液，稍振動后，加入15mL溶菌酶。混勻后，37℃水浴10min。加入30μL、體積分數為10%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，37℃水浴30 min。加入100 μL 5 mol/L NaOH溶液，80 μL、體積分數為2%的十六烷基三甲基溴化銨（hexadyltrimethyl ammomum bromide，CATB）溶液。混勻后65℃水浴10 min。依次加入250 μL苯酚、750 μL氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）混合液，離心，取上清液，繼續依次加入250 μL苯酚及250 μL氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）混合液進行抽提，離心10 min。重復2～3次。取上清液，加入20 μL 0.1倍體積的醋酸鈉后，加入相同體積的無水乙醇，封口，然后將EP管放置于4℃冰箱4～6 h，備用。收集DNA：用體積分數為70%乙醇溶液洗滌，離心，抽干，加50 μL無菌水，溶解后于-20℃保藏備用。

（2）PCR擴增[14]

PCR擴增上游引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

PCR反應體系總體積為50 μL，每管中加入25 μL Easy TaqSuper Mix，引物各2mL，模板DNA 2μL，雙蒸水19 μL，并做空白對照。

PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，55℃退火60 s，72℃延伸60 s，循環35次；最后72℃延伸10 min。取2μLPCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mLGoldview核酸染料），110 V電壓下電泳30 min，在凝膠成像儀中觀察結果。

（3）系統發育樹的構建

測序結果在美國國家生物技術信息中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）BLAST中進行同源序列比對，根據比對的結果，選取相似性99%以上菌種的ITS區DNA序列，連同測序菌株的序列用Claustal X1.83軟件進行多序列比對，采用MEGA 6.0軟件中的鄰近法（neighborjoining，NJ）進行系統發育樹的構建，并用Bootstrap對進化樹進行1 000次置信度分析。

1.3.5 酵母菌的富硒能力分析

（1）菌株的活化

將已經鑒定完成的菌株，接種于YEPD液體培養基，在28℃恒溫培養箱中培養48 h。

（2）菌株的擴大培養

將新鮮菌液按10%的接種量再次接于YEPD液體培養基中，在28℃恒溫培養箱中培養24 h，以保證菌體穩定在對數期，以便后續研究中保持菌株穩定的活性。

（3）不同硒濃度中菌株生長曲線繪制

將新鮮菌液按4%接種量接種于亞硒酸鈉含量分別為140 μg/mL、160 μg/mL、180 μg/mL、200 μg/mL的5 mL的YEPD液體培養基中，每個濃度梯度3個平行，29℃搖床培養，每隔4 h取樣1 μL，置于比色皿中，以空白培養基為對照，在波長600 nm的條件下測定OD600nm值。

（4）酵母菌生物量的測定[15]

酵母培養液于3 500 r/min離心10 min，棄上清液，用蒸餾水洗滌菌體3次，再次離心，65℃烘干即得酵母菌體，稱質量，得到菌體生物量（g/L）。

（5）酵母菌總硒含量的測定[16]

取5 mL種子液接種于裝有200 mL YEPD液體培養基中，30℃、180r/min振蕩培養24h，然后4000r/min離心5min，無菌生理鹽水洗滌3次，-80℃預凍12 h，冷凍干燥。

取0.10g凍干酵母樣品于消化瓶中，加入少量純水濕潤樣品，然后加入12 mL體積分數為65%的硝酸、3 mL體積分數為70%的高氯酸于電爐上冷凝回流消化至無色，將消化完的樣品移入燒杯中，并用少量水洗消化瓶，沖洗液一并移入燒杯中，加5%EDTA-2Na 2 mL，用40%NaOH調至中性，然后定容至100mL，以無菌水代替酵母樣品作為空白對照。

硒標準曲線的制作：分別量取0、2mL、4mL、6mL、8mL、10 mL，10 mg/L亞硒酸鈉溶液于分液漏斗中，加入2～3 mL純水和5%EDTA-2Na 1mL，用5%NaOH調pH至中性，然后加入2 mol/L甲醛1 mL，加純水至35 mL，各加0.5%3,3-二氨基聯苯按鹽酸鹽5 mL，搖均，暗處反應30 min，用5%NaOH調pH 6.5～7.0，加入甲苯10 mL，振蕩萃取1 min，靜置分層后，取甲苯層，在波長420 nm條件下比色，以甲苯為空白，以總硒含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制硒標準曲線。

樣品中總硒含量的測定：準確稱取0.100 0酵母粉置于燒杯中，加入5 mL混合消化液（濃硝酸與高氯酸，體積比4∶1），蓋上培養皿，消化至樣液呈無色透明為止，用水定容至50 mL。取該溶液10 mL作為樣液，測定方法同標樣，總硒含量的計算公式如下：

式中：X為樣品中總硒含量，μg/g；C為從標準曲線得到的硒含量，μg/L；V為樣品消解時定容的體積，L；m為樣品的質量，g。

1.3.6 富硒發酵條件單因素試驗

接種量對菌體發酵產硒的影響：分別以4%、6%、8%、10%、12%接種量接種到富硒培養基，30℃、200 r/min搖床振蕩培養8 h，考察不同接種量對菌株富硒能力的影響。

碳源濃度對菌體富硒能力的影響：按10%的接種量接種于發酵培養基，分別取葡萄糖添加量為1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%，菌株在28℃、200 r/min搖床振蕩培養8 h，考察不同葡萄糖添加量對菌株富硒能力的影響。

氮源濃度對菌體富硒的影響：按10%的接種量接種于發酵培養基，分別取蛋白胨添加量為1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%。在28℃、200 r/min搖床振蕩培養8 h，考察不同蛋白胨添加量對菌株富硒能力的影響。

1.3.7 富硒發酵條件優化正交試驗

根據單因素試驗結果，以發酵液中酵母菌生物量和總硒含量作為評價指標，選取接種量（A）、葡萄糖添加量（B）、蛋白胨添加量（C）為主要影響因素，優化富硒發酵條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 富硒發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for seleniumenriched fermentation conditions optimization

1.3.8 數據處理與分析

采用Origin8.0數據分析軟件進行單因素分析，用SPSS數據分析軟件進行正交分析。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的篩選

將實驗室保藏的60株酵母菌經過富硒平板培養基的初步篩選，得到4株富硒酵母菌，命名為菌株Z4、Z5、Z7、Z9。

2.2 酵母菌的形態觀察

菌落形態結果見圖1。由圖1可知，菌株Z4、Z5、Z9菌落形態較大，呈圓形，飽滿，白色，表面粗糙，邊緣整齊，易挑起；菌株Z7菌落形態較大，呈圓形，白色，中間凸起，表面粗糙，邊緣整齊，易挑起。

圖1 菌株在富硒培養基上的菌落形態Fig.1 Colony morphology of strains on selenium-enriched medium

2.3 酵母菌的分子生物學鑒定

（1）富硒酵母菌ITS區rDNAPCR擴增產物的電泳檢測結果

對4株富硒酵母（Z4、Z5、Z7、Z9）的DNA進行ITS區PCR擴增，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖2。由圖2可知，其中每個菌株具有單一條帶，且條帶較亮，長度在500 bp左右，故符合測序要求，擴增產物在華大基因測序公司進行測序。

圖2 ITS rDNA PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of ITS rDNA PCR amplification products

（2）菌株的進化樹分析

將4株富硒酵母菌（Z4、Z5、Z7、Z9）ITS區DNA測序結果置于NCBI庫中進行序列比對，利用MEGA 6.0軟件構建菌株的系統發育樹，結果見圖3。

圖3 菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains

由圖3可知，菌株Z4、Z5、Z7、Z9和庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）親緣關系最近，且分枝置信度是99%，故菌株Z4、Z5、Z7、Z9被初步鑒定為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

2.4 酵母菌的富硒能力分析

2.4.1 富硒菌株的生長曲線

取菌株Z4、Z5、Z7、Z9的活化菌液，按4%接種量接種于亞硒酸鈉含量分別為140 μg/mL、160 μg/mL、180 μg/mL、200 μg/mL的YEPD液體培養基中，在600 nm的波長條件下測定OD600nm值，繪制菌株Z4、Z5、Z7、Z9的生長曲線，結果見圖4。

由圖4可知，菌株Z4、Z5、Z7、Z9在不同硒濃度中的生長情況基本一致，在0～8 h處于對數生長期，而在8 h時進入穩定期。菌株Z4、Z5、Z7、Z9最大耐硒質量濃度分別為180 μg/mL、200 μg/mL、140 μg/mL及160 μg/mL。結果表明，與其他菌株相比，菌株Z5具有最強的耐硒性，因此，選取菌株Z5作進一步富硒研究。

圖4 菌株Z4(A),Z5(B),Z7(C)和Z9(D)的生長曲線Fig.4 Growth curves of strains Z4(A),Z5(B),Z7(C)and Z9(D)

2.4.2 硒標準曲線的繪制

以總硒含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制硒標準曲線，結果見圖5。

圖5 硒標準曲線Fig.5 Standard curve of selenium

由圖5可知，硒標準曲線回歸方程為y=0.0249x+0.0025，相關系數R2為0.999 6，表明二者線性關系良好。

2.5 菌株Z5富硒發酵條件優化單因素試驗

2.5.1 不同接種量對菌株Z5富硒能力的影響

圖6 不同接種量對Z5菌株富硒能力的影響Fig.6 Effect of different inoculum on selenium-enriched capacity of strain Z5

由圖6可知，隨著接種量的增加，由于發酵液中有限的營養成分，酵母菌種內競爭加劇，使得菌株Z5的富硒量和生物量均呈現先增加后減少的變化趨勢。當接種量在4%～10%時，硒含量及生物量隨接種量增加而增大；當接種量為10%時，富硒能力達到最大值，此時生物量約為9.6g/L，總硒含量將近870 μg/g；當接種量＞10%之后，總硒含量及生物量有所下降。因此，確定最佳接種量為10%。

2.5.2 不同葡萄糖添加量對菌株Z5富硒能力的影響

圖7 不同葡萄糖添加量對菌株Z5富硒能力的影響Fig.7 Effect of different glucose addition on selenium-enriched capacity of strain Z5

由圖7可知，隨著葡萄糖添加量的增加發酵液中酵母菌快速繁殖，種內對養分和空間的競爭加劇，菌株Z5的硒含量和生物量同樣呈現先增加后減少的變化趨勢。當葡萄糖添加量為1.6%～2.2%時，硒含量及生物量隨葡萄糖添加量增加而增大；當葡萄糖添加量為2.2%時，富硒能力達到最大值，此時硒含量達到860 μg/g，生物量達到9.4 g/L；當葡萄糖添加量＞2.2%之后，硒含量及生物量有所下降。因此，確定最佳葡萄糖添加量為2.2%。

2.5.3 不同蛋白胨添加量對菌株Z5富硒能力的影響

圖8 不同蛋白胨添加量對Z5菌株富硒能力的影響Fig.8 Effects of different peptone addition on selenium-enriched capacity of strain Z5

由圖8可知，隨著蛋白胨添加量的增加，引起發酵液中酵母菌快速繁殖，種內對養分和空間的競爭加劇，Z5菌株的富硒量和生物量呈現先增加后減少的變化趨勢。當蛋白胨添加量為1.6%～1.8%時，硒含量及生物量隨蛋白胨添加量增加而增大；當蛋白胨添加量為1.8%時，富硒能力達到最大值，此時的硒含量達到840μg/g，生物量達到9.7 g/L；當蛋白胨添加量＞1.8%之后，硒含量及生物量有所下降。因此，確定最佳蛋白胨添加量為1.8%。

2.6 菌株Z5富硒能力優化正交試驗

根據單因素試驗結果，以酵母總硒含量作為評價指標，選擇3因素3水平對菌株Z5的富硒發酵條件進行優化，正交試驗結果與分析見表2。

表2 富硒發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for selenium-enriched fermentation conditions optimization

由表2可知，對菌株Z5富硒能力的影響主次順序為C＞B＞A，即蛋白胨添加量＞葡萄糖添加量＞接種量，得到菌株Z5最佳富硒發酵條件為A2B3C1，即接種量10%，葡萄糖2.4%，蛋白胨1.8%，在此最佳條件下進行3次驗證試驗，總硒含量為862 μg/g，生物量為9.63 g/L。

3 結論

選取實驗室保藏的酵母菌為研究對象，通過篩選、純化，得到4株富硒酵母菌。采用形態觀察、現代分子生物學鑒定方法，將菌株Z4、Z5、Z7、Z9初步鑒定為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。對菌株Z4、Z5、Z7、Z9進行硒耐受性分析，發現菌株Z5具有最強耐硒性，耐硒質量濃度可達200 μg/mL。通過單因素及正交試驗對最適富硒發酵條件進行優化，得出菌株Z5的最佳富硒條件為接種量10%，葡萄糖2.4%，蛋白胨1.8%。在此優化條件下，總硒含量可達到862 μg/g，生物量為9.63 g/L。本研究對富硒酵母菌種的開發提供了一定的理論依據。

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