趨化因子CCL2對STEMI患者殘余血小板活化的影響

曹禹，于淼，喬銳，童芳念，程茗慧，李春輝，劉丹

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是嚴重威脅人類健康并影響人類生存的主要疾病之一[1]。AMI是在冠脈粥樣硬化不穩定斑塊破裂的基礎上繼發了血栓形成，導致冠脈變窄甚至完全閉塞引起的心肌缺血甚至壞死。炎癥反應及血小板的聚集和激活在冠脈血栓形成過程中扮演著重要角色[2]。目前，AMI的主要治療策略是經皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)治療及圍術期開始的長期雙聯抗血小板治療。氯吡格雷和阿司匹林是常用的抗血小板藥物，主要作用是抑制血小板ADP受體和血栓素A2的生成，在一定程度上緩解患者的臨床癥狀并改善患者預后，但仍有部分患者再次發生缺血性事件，部分原因歸咎于氯吡格雷抵抗[3]。

新型抗血小板藥物替格瑞洛(商品名：倍林達)為非前體藥，不需要肝臟代謝，具有可與P2Y12 ADP受體可逆性結合，抑制血小板作用較強，可降低急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者不良心血管事件風險等優勢。心血管臨床醫生及相關臨床研究人員在很長一段時間內認為ACS患者服用替格瑞洛后不會發生殘余血小板高反應，且可以完全改善患者因服用氯吡格雷帶來的不良后果。但是，隨著研究的不斷深入，諸多研究證實ACS患者即使服用替格瑞洛，仍然不能避免血栓事件的發生[4-5]，說明仍有一定程度的殘余血小板聚集和活化。因此，尋找參與殘余血小板聚集和活化的關鍵調控分子至關重要。

趨化因子CCL2在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和ACS的發生發展過程中具有重要作用[6-9]。CCL2通過與其特異性受體CCR2結合而發揮生物學效應，可以趨化血液循環中的單核細胞至動脈粥樣病變區域[10-11]。本研究探討CCL2對STEMI患者服用替格瑞洛后殘余血小板活化的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 連續入選自2015年4－9月沈陽軍區總醫院CCU收治的STEMI患者80例。入選患者均為漢族，年齡35～75歲，均有持續30min以上的典型胸痛，發病時間＜12h；心電圖顯示ST段呈弓背向上型抬高及動態演變過程；冠脈造影顯示冠脈左前降支、左回旋支及右冠狀動脈中有1處或多處血管狹窄程度超過75%。排除近期患有嚴重肝腎疾病、血液系統疾病、腫瘤性疾病、先天性心臟病、心臟瓣膜疾病、自身免疫病、活動性炎性疾病、血流動力學不穩定、嚴重心衰等疾病及既往行PCI或冠狀動脈搭橋手術的患者。本研究經沈陽軍區總醫院倫理委員會同意，入選的研究對象均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料采集 詳細記錄入選患者的入院時間、年齡、性別等一般情況；冠心病的常見危險因素：吸煙史、糖尿病病史、高血壓病史；實驗室檢查結果：空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、腦尿鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)和肌鈣蛋白T(Troponin T，TnT)等。

1.3 樣本采集及分組 入選的80例患者均服用180mg替格瑞洛，300mg阿司匹林腸溶片(商品名：拜阿司匹林)，隨后進行PCI治療，術中應用肝素或比伐蘆定抗凝，均未應用替羅非班等ⅡbⅢa受體拮抗藥。術后規律服用90mg替格瑞洛，2次/d，100mg阿司匹林腸溶片，1次/d。連續抽取80例服用替格瑞洛患者的靜脈血，采血時間點為服藥后

2、4、6h，每個時間點用含EDTA的真空抗凝管采集3ml靜脈血，用含枸櫞酸鈉的真空抗凝管采集3ml靜脈血。按照文獻[12]報道，根據光比濁法檢測的殘余血小板聚集率(residual platelet aggregation rate，RPA)數值不同將患者分為兩組，RPA≥59%為殘余血小板高反應組(高反應組)，RPA＜59%為殘余血小板正常反應組(正常反應組)。

1.4 ELISA檢測血漿CCL2水平 制備CCL2標準品，每孔先加入50μl稀釋液RD1-83，再加入200μl標準品或待測樣品，室溫孵育2h；棄去液體，加入400μl沖洗緩沖液，洗3次后拍干；加入200μl CCL2結合溶液，室溫孵育2h；加入200μl底物溶液，避光孵育30min；加入50μl終止液，在酶標儀上檢測。繪制標準曲線，根據公式計算出每個待測樣品的濃度。

1.5 光比濁法檢測ADP誘導的人RPA值 采用含枸櫞酸鈉的真空抗凝管采集人靜脈血3ml，室溫下800r/min離心10min，上清為富含血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)。將PRP移至新的EP管，余下的血標本于室溫下3000r/min離心10min，上清為貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)。打開光比濁檢測儀(光透射儀)，取250μl PPP加入到血小板反應杯中，再將血小板反應杯插入檢測儀的檢測孔中調零。取225μl PRP加入血小板反應杯中，放入磁珠，將帶有磁珠的血小板反應杯插入檢測儀的檢測孔中。將25μl ADP(20μmol/L)作為血小板誘導劑迅速加入檢測孔，37℃條件下1000r/min開始檢測，電腦顯示血小板聚集率情況，共記錄10min。待反應結束后，記錄人RPA最大值。

1.6 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；兩組分類變量的比較采用χ2檢驗；患者RPA值與血漿CCL2濃度之間的關系應用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者臨床基線資料及RPA比較 服藥后2、4、6h時間點正常反應組患者分別為45例、57例、66例，高反應組患者分別為35例、23例、14例，殘余血小板高反應比例分別為43.8%、28.8%、17.5%。服藥后各時間點，兩組臨床基線資料比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。各時間點高反應組的RPA值均明顯高于正常反應組，差異有統計學意義(P=0.000，表1)。

2.2 患者血漿中CCL2濃度的差異及其與RPA的相關性

2.2.1 兩組患者血漿CCL2濃度比較 服藥后2、4、6h，高反應組患者血漿CCL2濃度分別為209.72±84.09、195.54±63.66、184.29±56.74pg/ml，明顯高于正常反應組(分別為167.52±36.92、160.63±42.31、152.43±42.48pg/ml)，差異均有統計學意義(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05，圖1)。

2.2.2 患者RPA值與血漿中CCL2濃度的相關性Pearson相關分析結果顯示，服藥后2、4、6h，患者RPA值與血漿CCL2濃度均存在線性關系(r=0.474、r=0.622、r=0.425，P＜0.01，圖2)。

表1 兩組各時間點服用替格瑞洛的STEMI患者基線資料及血小板聚集率比較Tab. 1 Comparison of the baseline data and platelet aggregation rate at different time points after taking ticagrelor in two groups

圖1 服用替格瑞洛后不同時間點兩組血漿CCL2濃度比較Fig. 1 Comparison of the plasma CCL2 concentration at different time points after taking ticagrelor in two group(ELISA)

3 討 論

圖2 不同時間點患者RPA與血漿CCL2濃度的相關性分析Fig. 2 The correlation of RPA and plasma CCL2 concentration at different time points

血小板沒有細胞核，但其內部含有多種細胞器及散在分布的顆粒成分，具有完整的轉錄組并可以翻譯蛋白質。血小板在止血、傷口愈合、炎癥反應、血栓形成及器官移植排斥等生理及病理過程中均發揮著重要作用[13]。血小板是構架血管炎癥和血栓形成之間必不可少的成分。當血管內皮損傷并且內皮下膠原暴露后，血小板與受損的內皮及暴露的膠原結合，促使血小板迅速發生活化，釋放血小板顆粒內的細胞因子、趨化因子等成分，這些顆粒分泌物進一步促進血小板的活化和聚集，形成正反饋；同時，這些顆粒分泌物還能與血小板膜上的G蛋白偶聯受體結合，誘導血小板內第二波激活信號，進而促使血小板顆粒分泌增加[14]。血小板活化、聚集和顆粒分泌在AS等炎癥性疾病中至關重要，主要表現為血小板與趨化因子共同作用并參與AS等炎癥性疾病的發生發展[15]。AS斑塊破裂后血小板黏附、聚集和激活不僅在冠脈血栓形成中發揮重要作用，在斑塊破裂處形成的血管阻塞中也同樣起作用，是缺血性疾病如AMI的主要病理基礎[16]。每個個體的血小板反應性不盡相同，其發生心血管終點事件的概率和嚴重程度也不盡相同，具有血小板高反應性的個體更容易發生血小板聚集及激活，發生缺血性事件的概率也要明顯高于血小板反應正常的個體[17]。因此，明確與血小板高反應相關的信號分子至關重要。

近年來，隨著人們生活方式的改變，心血管疾病患者日益增多，AMI是嚴重威脅人類健康的常見的重大疾病之一。AMI發病急，發病率和病死率呈持續升高趨勢，其中冠脈粥樣硬化病變部位的炎癥反應及粥樣硬化斑塊的破裂發揮著關鍵作用[18]。積極抗血小板治療是目前主要的治療手段之一，然而，由于大部分抗血小板藥物作用機制單一，無法完全拮抗血小板，引起殘余血小板的再次活化和聚集，導致一部分患者發生主要心腦血管不良事件。RAPID研究[19]報道了25例STEMI患者服用180mg負荷劑量的替格瑞洛后，2h和4h的殘余血小板高反應比例分別為60%和35%。RAPID2研究[20]報道即使增加替格瑞洛負荷劑量至360mg，25例STEMI患者服藥后2h的殘余血小板高反應比例仍有32%。本研究發現，80例服用替格瑞洛的STEMI患者，應用光比濁法檢測患者服藥后2、4、6h的RPA值，均有一定比例的殘余血小板高反應。可見，探尋發生殘余血小板高反應的原因或者發現調控血小板聚集和活化的關鍵因子尤為重要。

趨化因子CCL2除了可趨化血液循環中的單核細胞至AS損傷部位，還可以作為始動因子誘導其他炎癥因子和組織因子的產生和釋放，促使AS的進展以及不穩定斑塊破裂所致的血栓形成[21]。本課題組前期應用熒光定量PCR、Western blotting、免疫組織化學等方法檢測經導管抽吸獲得的STEMI患者冠脈血栓組織中CCL2和CCR2的表達，發現無論在RNA或是蛋白水平，其表達均增高，且免疫熒光染色觀察發現CCL2和CCR2均可以與血小板標記物CD62p共定位，提示CCL2/CCR2可能通過對血小板的調控參與冠脈血栓形成。本課題組前期研究還發現，STEMI患者服用氯吡格雷4～6h后，通過光比濁法檢測患者RPA，高反應組患者血漿中CCL2的濃度明顯高于正常反應組，而且RPA與血漿中的CCL2濃度存在線性相關[22]。本研究發現，80例服用替格瑞洛的STEMI患者服藥后2、4、6h，高反應組患者血漿中CCL2的濃度仍明顯高于正常反應組，而且各時間點檢測的RPA值與血漿中CCL2濃度之間均存在線性關系。然而，按照患者服藥后不同時間點檢測的RPA值分組，高反應組患者臨床基線資料中各項指標均與正常反應組患者相匹配，與各時間點應用光比濁法檢測的RPA值及血漿中CCL2濃度均無相關性，說明RPA值與血漿中CCL2表達水平的相關性未受基線指標等因素的干擾，提示CCL2可能參與了殘余血小板的活化和聚集。

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