2型糖尿病周圍神經病變患者外周血CD4+調節性T細胞與25-（OH）D3的關系及其意義*

秦宏超，張真穩

（揚州大學臨床醫學院 內分泌科，江蘇 揚州 225100）

糖尿病（diabetes mellitus, DM）周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathies, DPN） 是DM主 要的慢性并發癥之一。≥50%的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）患者合并有DPN，≥1/3的DPN患者存在針刺、燒灼及電擊等疼痛癥狀[1]，嚴重影響患者正常的工作和生活，也是DM晚期致死、致殘的主要原因之一。T2DM及其并發癥的發病機制涉及多方面，免疫機制也參與其中。由于疾病病因和長期病程，患者免疫功能多受到影響，細胞免疫平衡被破壞，其中T淋巴細胞亞群的變化尤為顯著。調節性T細胞（T-regulatory cell, Tregs）是一類具有獨特免疫調節功能的T細胞亞群，在維持機體的免疫穩態和控制自身免疫病的進展方面具有重要作用[2]。維生素D（vitamin D, VD）除作為鈣、磷代謝調節劑參與骨代謝外，還具有免疫調節作用（包括調節Tregs各個亞群比例、促進CD4+T分化及上調Tregs活性等）。血清25-羥維生素D3[25-（OH）D3]在DPN患者的糖代謝、營養神經、氧化應激及免疫調節方面均發揮作用[3-5]，與DPN具有相關性[6]。本文旨在探討DPN患者25-（OH）D3和CD4+Tregs的關系及其意義，為DPN的發生機制和治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月-2017年7月該院就診的T2DM患者42例。其中，男性26例，女性16例；病程1～40年，平均10.5年；年齡35～86歲，平均（60.36±12.22）歲。所有患者均符合1999年世界衛生組織的DM診斷標準。排除標準：①非DM因素導致的神經病變（如腰椎病變、VB12缺乏及格林-巴利綜合征等）、甲狀腺功能亢進癥及惡性腫瘤等；②合并有DM高滲昏迷、低血糖及DM酮癥酸中毒等急性并發癥；③合并有各類急性或慢性感染；④有骨質疏松和其他骨代謝異常疾病病史；⑤肝腎功能障礙、心功能不全及甲狀旁腺疾病；⑥半年內使用過甲狀旁腺激素、降鈣素、類固醇激素、VD制劑及性激素等藥物。

1.2 方法

1.2.1 一般資料采集 記錄每位患者性別、年齡、DM病程等一般數據，測量身高、體重，計算體重指數（body mass index, BMI）。

1.2.2 實驗室檢查 所有受試者空腹≥8 h，于次日清晨抽取靜脈血，采用AU2700型全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）測定TG、TC、HDL-C、LDL-C、Scr、BUM及尿微量白蛋白（urine microalbuminuria,UMA）；采用糖化血紅蛋白測定儀（美國Bia-rad公司）對HbA1c水平進行測定。

1.2.3 VD3水平測定及分類 抽取所有受試對象空腹靜脈血，采用25-（OH）D3試劑盒（英國IDS公司）用酶聯免疫吸附測定法測定。依據25-（OH）D3的水平：≤50 nmol/L為VD3缺乏；50～75 nmol/L為VD3不足；≥75 nmol/L為VD3充足[7]。

1.2.4 CD4+Tregs檢測 使用PF-anti-CD25/FITC-anti-CD4熒光標記抗體（美國Serotec公司）標記兩組分離好的單個核細胞樣本，采用流式細胞儀（美國BD公司）進行Tregs檢測，采用CXP Cytometer（美國貝克曼庫爾特公司）對數據進行收集和分析。

1.2.5 DPN診斷 對受試者使用肌電誘發儀（日本光電工業株式會社）進行肌電圖檢查。確診DPN標準[8]：在明確診斷DM同時或之后出現神經病變，臨床表現與DPN表現（麻木、疼痛及感覺異常等）相符；5項檢查（溫度覺、足部感覺、踝反射、振動覺及神經傳導速度）≥2項為異常。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）或中位數（四分位數）表示，比較用t檢驗，不滿足或用軼和檢驗，相關分析采用Pearson法或Spearman法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組年齡、25-（OH）D3水平及Tregs百分比比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組 BMI、HbA1c、UMA、BUM、Scr及血脂分析等比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 兩組外周血25-（OH）D3水平和Tregs百分比的比較

兩組外周血25-（OH）D3水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），DPN組外周血25-（OH）D3水平比非DPN組更低（P＜0.05）；兩組外周血Tregs百分比比較，差異有統計學意義（P＜0.05），DPN組外周血Tregs百分比非DPN組更低（P＜0.05）。見表1和附圖。

2.3 DPN組外周血Tregs百分比與各臨床指標相關性分析

DPN組外周血Tregs百分比與25-（OH）D3呈正相關（P＜0.05），與年齡、BMI、HbA1c、UMA、BUM、Scr、TC、TG、HDL-C、LDL-C 無相關性（P＞0.05）。見表2。

附圖 兩組Tregs百分比的比較

表2 DPN組外周血Tregs百分比與臨床指標相關性

3 討論

近年來，Tregs作為維持機體免疫耐受的一個重要調控者備受關注。研究顯示，T2DM外周血淋巴細胞的數量和比例以及相關炎癥因子的改變，支持CD4+、CD25+Tregs參與DM微血管病變過程。楊雪等[9]研究發現，DPN患者外周血中CD4+、CD25+Foxp3+Tregs數量減少，可能是導致DPN患者神經組織自身免疫性損傷的原因之一。但DPN發病過程中Tregs所起作用進行的深入研究仍然較少。

VD作為一種脂溶性維生素，主要通過與其受體結合，調控基因轉錄，進一步發揮其生物學作用。VD在體內的主要存在形式為血清25-（OH）D3，是目前評價VD營養狀況最有效指標[10]。多項研究表明，T2DM中VD缺乏與DPN相關，且VD缺乏可作為DPN發病的危險因子[11-12]。SHEHAB等[13]給57例VD缺乏DPN患者補充外源性VD后發現，VD能有效緩解DPN患者的臨床癥狀，使疼痛評分得到改善。充足的VD還可降低中老年人罹患T2DM的風險[14-15]。而低于人群VD水平中位數的T2DM患者，5年后發生微血管并發癥的概率增高[16]。VD對DPN的影響機制還不明確，研究證實VD可通過影響微血管功能、抑制炎癥反應因子及直接保護作用對外周神經發揮作用[17-21]。筆者早期研究結果顯示，T2DM DPN與VD水平有關[22]，本研究也證實DPN組25-（OH）D3水平較對照組降低，DPN患者普遍存在VD缺乏現象，進一步證實25-（OH）D3或參與DPN發生、發展。

近期研究表明，VD除經典的鈣磷調節功能外，還在免疫調節中發揮重要作用，其主要的靶細胞（包括T淋巴細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞等）抗原遞呈細胞。VD可抑制T淋巴細胞的增殖、介導T細胞的凋亡并且改變Th1與Th2細胞之間的比例[23]。有研究表明，25-（OH）D3和轉化生長因子β的聯合刺激下，可增加FoxP3+調節性T細胞的表達，同時促進原始CD4+T細胞向Tregs分化[24]，此結論在URRY等[25]體外實驗中也得到證實。PRIETL等[26]臨床研究指出，在血清25-（OH）D3充足的正常對照組的外周血淋巴細胞中，Tregs所占比例增高，兩者呈正相關。王琦等[27]在動物實驗中發現，VD能刺激Tregs分泌的抑制性細胞因子產生白細胞介素10，從而發揮生物學作用。

綜上所述，本研究結果支持DPN患者外周血CD4+Tregs與 25-（OH）D3水平相關。25-（OH）D3可通過影響DPN患者Tregs表達而影響DPN的發生、發展，為進一步揭示DPN發病機制提供新方向，VD或成為未來治療DPN的一個新靶點，其能否通過補充外源性VD來調節T細胞的免疫功能，進而改變DPN進程，則需要更多的臨床實驗進一步證實。