癌性腹水模型制備方法及在中醫(yī)藥作用機制研究中的應用

姚芳 曹雨誕 張楷承 姜東京 張麗

中圖分類號 R730.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）06-0856-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.06.31

摘 要 目的：探討癌性腹水模型的制備方法及其在中醫(yī)藥作用機制研究中的應用，以期為中醫(yī)藥治療癌性腹水的基礎研究提供實驗參考。方法：檢索中國知網、萬方數據知識服務平臺、維普網、PubMed中于1985年1月至2017年8月國內外公開發(fā)表的有關中醫(yī)藥治療癌性腹水的文獻，最終納入60篇文獻。分別介紹了常用的4種癌性腹水實驗動物模型（Walker-256細胞株大鼠腹水模型、H22細胞株小鼠腹水模型、S180細胞株小鼠腹水模型、艾氏腹水瘤小鼠腹水模型）的制備方法和模型特點，并對不同動物模型應用于中藥藥理活性研究、峻下逐水藥的毒效研究、中藥復方研究等進行了綜述。結果與結論：癌性腹水主要是由于惡性腫瘤滲透物或分泌物侵犯漿膜，引起腹膜腔液異常累積而形成，其治療困難、預后較差。近年來，中醫(yī)藥用于治療癌性腹水顯示出一定優(yōu)勢，前景良好。而癌性腹水動物模型作為中醫(yī)藥作用機制研究的重要載體，能恰當地模擬癌性腹水形成、發(fā)展的病理過程，有助于開展中藥治療方法的相關基礎研究。常用的4種癌性腹水實驗動物模型制備方法基本相同，多采用腹腔注射癌細胞株，操作簡單，成模率高。4種腹水型瘤細胞株各有特點，可根據實驗需要進行選擇。但由于癌性腹水證候復雜多變，因此尚需探索建立與中醫(yī)證候相結合的新的癌性腹水動物模型，為中藥治療癌性腹水的機制研究提供更多選擇。

關鍵詞 動物模型；癌性腹水；中醫(yī)藥；機制研究

癌性腹水，又稱惡性腹腔積液，是中晚期癌癥常見的臨床表現之一，其發(fā)生機制非常復雜，主要是由于惡性腫瘤滲透物或分泌物侵犯漿膜，引起腹膜腔液異常累積，從而導致腹水貯留[1-2]。癌性腹水具有量大、頑固、反復出現的特點，且治療困難、預后差，嚴重降低了患者的生存質量；其發(fā)病和加重會導致患者異常腹脹和胸腔壓迫，且通常為不良預后的信號[3]。目前，臨床上已經使用各種治療策略以緩解這一癌癥并發(fā)癥，如用于緩解癥狀的簡單腹水引流、利尿藥、水鹽控制攝入和輸注白蛋白，以及用于治療相關惡性腫瘤的化療配合反復穿刺抽液和手術等[4-5]。然而，由于上述治療方式的作用時間短，以及不可避免的副作用如腸梗阻、膿毒癥和感染等，故并未取得令人滿意的效果。因此，迫切需要更有效和安全的治療方式來減輕癌性腹水患者的痛苦并延長其生存期。近年來，中醫(yī)藥在癌性腹水的治療上已取得初步成果，如研究發(fā)現甘遂、京大戟、芫花等單味中藥和十棗湯、舟車丸等中藥復方在治療腹水和改善患者生存狀況方面有一定的優(yōu)勢[6-10]，其良好的綜合療效已初步顯現，已成為新的研究熱點和開發(fā)方向。基于中藥研究的特殊性，要求所構建的中醫(yī)病證結合藥理模型能盡可能地通過實驗動物模擬患者的臨床特征，以體現中醫(yī)臨床的診療特點[11]；此外，又因癌性腹水機制復雜，需通過動物模型來闡述藥物的作用機制，因此中醫(yī)藥治療癌性腹水研究中動物模型的選擇就顯得尤為重要。基于此，本文對常用的4種癌性腹水實驗動物模型的制備方法及其在中醫(yī)藥作用機制研究中的應用情況進行了綜述，旨在為中醫(yī)藥治療癌性腹水的基礎研究提供實驗參考。

1 文獻來源

1.1 納入與排除標準

納入標準：（1）研究內容為癌性或惡性腹水模型及作用機制的文獻；（2）治療方法采用中醫(yī)藥的文獻。排除標準：（1）不符合納入標準的文獻；（2）重復發(fā)表的論文，僅取1篇，其余排除。

1.2 檢索方式及檢索范圍

以“癌性腹水模型”“惡性腹水模型”“Cancerous ascites model”“Malignant ascites model”等中英文關鍵詞檢索中國知網（www.cnki.net）、萬方數據知識服務平臺（www.wanfangdata.com.cn）、維普網（www.cqvip.com）、PubMed（www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）從1985年1月至2017年8月國內外公開發(fā)表的有關癌性腹水的文獻（因相關文獻較少，所以時間跨度較大，但以近10年發(fā)表的文獻為主）。結果，經檢索并按照文獻納入與排除標準，共納入60篇文獻。

2 癌性腹水形成機制的中醫(yī)觀點

癌性腹水可歸屬為中醫(yī)“臌脹”之范疇，為腫瘤的常見并發(fā)癥，是“血不利則為水”及“水不利則為血”兩種機制共同作用的病理狀態(tài)。癌性腹水一般是由肺、脾、腎功能失調導致陽虛氣滯從而出現水泛濫的結果，有關記載最早見于中醫(yī)典籍《靈樞·水腫》。究其發(fā)病原因，多指虛實交錯、本虛標實、氣血水液運行受阻，水積于胸腹而形成；或因正虛邪毒乘虛而入日久而成；又因腫瘤傷精敗血、損及元氣、氣血雙虧，或手術放療、化療后大傷氣陰，使正氣不足、脾虛氣虛、水濕不化而致。傳統(tǒng)治療方法為行氣、活血、利水[12-13]。宋鳳麗等[14]依據中醫(yī)理論分析認為，“水停”應責之于脾腎陽虛，尤其以腎陽虛衰為疾病的根本；加之病程較長，水為陰邪，易傷陽氣；此外，還有失治誤治，使脾腎陽氣損傷的原因。腎陽不足則不能化氣行水，脾陽虛弱則不能運化水濕，因此則生“臌脹”。中醫(yī)專家章永紅認為，癌性腹水以氣陰虧虛為主，脾虛而使運化失職、水濕內停而生腹水，并總結出“癌毒為本、腹水為標”的病機認識[15]。以上中醫(yī)觀點認為，此病的病源是水運行受阻、蓄積于胸腹而形成的。

3 癌性腹水形成機制的現代醫(yī)學觀點

癌性腹水形成機制復雜，目前已有研究歸納出的病因為以下幾類：（1）葉晶琳、李巖、徐珩等[16-18]認為腫瘤血管新生和血管通透性增高在癌性腹水形成過程中的作用至關重要。各種實體瘤轉移形成腹水的機制本質上是相同的，癌性腹水形成的主要原因是血管內皮生長因子（VEGF）、基質金屬蛋白酶（MMPs）、血管內皮抑素（ES）、細胞黏附分子（CAMs）及胰島素樣生長因子Ⅰ型受體（IGF-IR）等物質導致新生血管形成及血管通透性增加。以腫瘤血管內皮細胞為靶點的靶向治療可以使新生血管得到控制，可有效抑制多種腫瘤引起的腹水，且不良反應較小。孫曉敏[19]也認為高水平VEGF、細胞黏附分子CD44剪接變異體6（CD44v6）以及高活性MMP-2、MMP-9可能參與了癌性腹水形成，并可能在癌性腹水形成過程中起協(xié)同促進作用。（2）β1腎上腺素受體（ADRB1）表達的增強或激活，可引起腹水的產生[20]。（3）磷脂酰肌醇3-激酶γ亞基（PIK3CG）作為磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）途徑的主要成分，已被報道參與了癌癥發(fā)生和癌性腹水形成的過程[21-22]。（4）腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)-內分泌水平的改變也與癌性腹水生成緊密相關[23]。研究癌性腹水的形成機制，對探索其可能的治療途徑并揭示藥物的作用機制具有重要意義，而建立穩(wěn)定、可靠的癌性腹水動物模型則是進行后續(xù)深入研究的關鍵。

4 常用癌性腹水動物模型

在藥物有效性評價中，實驗動物模型是最常用、最可靠的工具之一[24]。目前，建立癌性腹水動物模型的方法多采用腹腔注射癌細胞株，不同點在于所選擇的動物的類別與癌細胞株的種類及濃度。常用癌性腹水實驗動物模型主要歸為4類[25]：（1）Walker-256細胞株大鼠腹水模型；（2）H22細胞株小鼠腹水模型；（3）S180細胞株小鼠腹水模型；（4）艾氏腹水瘤（EAC）小鼠腹水模型。不同類別癌性腹水動物模型詳見表1。

4.1 模型制備

上述4種模型的造模步驟大致相同，即抽取腹水、細胞計數、接種。具體造模方法[25-27]：將凍存的細胞株在37 ℃下迅速解凍復蘇，離心5 min，棄去上清液，用生理鹽水懸浮沉淀調節(jié)細胞至一定濃度，待用；對動物（大鼠或小鼠）腹腔注射細胞懸液進行細胞傳代，7～10 d后，腹水生成明顯；挑選腹水多的動物，脫頸椎處死，浸入酒精中浸泡5 min后置于蠟板上，在超凈臺內于無菌條件下用碘酒、酒精消毒動物腹部，抽取乳白色濃稠液體腹水為瘤源；以后每7 d動物體內傳代1次，形成穩(wěn)定的傳代體系，直至傳代約3～5代即可進行實驗。將傳代后獲得的活體腹水細胞用生理鹽水稀釋，搖勻，然后用臺盼藍染色，于顯微鏡下進行細胞分類計數，其中存活的瘤細胞比例應不低于95%。另取動物，以75%乙醇消毒腹部，腹腔注射活體腹水細胞懸液（調整細胞濃度至適當范圍），制備癌性腹水模型。

4.2 Walker-256細胞株大鼠腹水模型

Walker-256乳腺癌細胞株是由Walker在1928年培育得到的[28]，其來源于大鼠乳腺組織自發(fā)性腫瘤，接種于大鼠腹腔內便可自行繁殖。該模型制作方法簡單、性質穩(wěn)定、周期短（7～10 d），且成模率高（>95%），動物自然生存時間為3～4周，因此被廣泛應用于建立癌性腹水模型和腫瘤相關動物模型[29-30]。曹亮亮等[31]用Walker-256瘤株較成功地復制了大鼠癌性腹水模型，以用于瀉水逐飲中藥藥效研究。

4.3 H22細胞株小鼠腹水模型

H22腫瘤瘤株系1952年蘇聯(lián)醫(yī)學科學院腫瘤研究院用致癌劑氨基-2，3-偶氮甲苯（OAAT）涂C3H小鼠的皮膚100次后誘發(fā)的肝臟實體型瘤株。1963年由中國科學院上海藥物研究所引進了皮下傳代的H22肝臟實體型瘤株，并轉變成腹水型瘤株（腹水型瘤株又稱Hca、HAC或HepA），并在昆明種小鼠腹腔內常規(guī)保存。H22瘤細胞移植于小鼠腹腔呈腹水型增長[32-33]。該腹水模型的特點為：H22細胞株侵襲力強，瘤細胞計數容易，模型可重復性強[34]。但有文獻報道，國內外各實驗機構在以往的造模過程中，常因無法很好地解決H22細胞腹腔接種和腹水形成的技術問題從而導致造模失敗[35]。克禎彧等[36]通過觀察小鼠的體質量變化，對雌雄小鼠的腹水生長狀況進行研究發(fā)現，不同性別H22腹水型肝癌模型小鼠的腹水形成有一定差異，雌性小鼠的腹水形成速度較雄性小鼠快。李永強等[37]利用荷H22腹水瘤小鼠的癌細胞成功制備了癌性腹水模型。

4.4 S180細胞株小鼠腹水模型

S180為肉瘤細胞株，常應用于腹水腫瘤模型的研究。肉瘤種系細胞差異小、適用性廣，其腹水瘤細胞具有成本低、活性高、分裂快、易被誘導凋亡及融合、純度較高等優(yōu)勢[38-39]。石躍進[40]采用S180癌性小鼠腹水模型，研究了加味五苓散治療癌性腹水的作用機制。

4.5 EAC小鼠腹水模型

EAC細胞株屬移植性腫瘤細胞。動物對該瘤株的敏感度較高，具有操作簡單、成模率高、個體差異小、較符合臨床特征等優(yōu)點[41-42]。

上述4種癌性腹水模型動物的腹水產生量均與接種瘤細胞數有密切關系[43]。李勇等[44]比較了不同濃度的腫瘤腹水接種動物后腹水產生的差異，得出結論：不適當地增加腫瘤細胞的腹水濃度并不能增加模型動物產生腹水的可能性，反而有可能激活動物本身的細胞和免疫功能，使腹水內的腫瘤細胞被消滅，導致產生腹水的成功率降低。這也提示，動物在進行腹腔腫瘤細胞傳代過程中，不要一味追求進入傳代動物腹腔的細胞數量，因為腫瘤細胞數量及異體蛋白太多均有可能激活接種動物的細胞和體液免疫，從而抑制腹水的生成；但同樣需注意，進入動物腹腔的腫瘤數量也不宜太少，否則會明顯延長腫瘤細胞在接種動物腹腔內擴增的時間，從而延長腹水的生成時間。

5 癌性腹水模型在中醫(yī)藥作用機制研究中的應用

5.1 中藥藥理活性研究

陳麗宏等[45]將S180腹水型肉瘤細胞株接種于小鼠腹腔，制備癌性腹水模型，然后以化學藥環(huán)磷酰胺作為對照，研究中藥蘆薈對癌性腹水模型小鼠的作用。結果表明，蘆薈全葉汁、皮汁、凝膠汁均可顯著抑制癌性腹水小鼠體質量的快速增加，減少腹水中白蛋白含量，并可使惡性腫瘤細胞生長停滯于細胞周期的S期，從而抑制癌性腹水的產生，實現對癌性腹水的治療作用；且蘆薈汁對正常細胞沒有直接毒副作用，與環(huán)磷酰胺等細胞周期非特異性藥物的作用機制不完全一樣。這提示，蘆薈可能有助于臨床癌性腹水的治療。

井小會[46]通過建立小鼠肝癌H22腹水瘤動物模型，研究人參皂苷Rg3對小鼠癌性腹水的治療效果。結果發(fā)現，人參皂苷Rg3可通過下調荷瘤小鼠體內VEGF和腹膜瘤結節(jié)微血管密度（MVD），降低微血管的通透性和抑制腹膜微血管形成，從而抑制癌性腹水的形成。

5.2 峻下逐水藥的毒效研究

峻下逐水藥為中醫(yī)瀉下藥的一個門類，其作用峻猛，服藥后能引起劇烈腹瀉，有的兼能利尿，使體內潴留的水飲通過二便排出體外從而消除腫脹，常用于全身水腫、大腹脹滿以及停飲等正氣未衰之證，代表藥物有甘遂、京大戟、芫花等[47]。由于該類中藥大多苦寒有毒，使其臨床應用目前被西藥和其他治療措施代替[48]。近年來，該類有毒中藥研究大多是在正常動物體內進行，割裂了中醫(yī)“藥-證”之間的關聯(lián)，忽略了中醫(yī)“有故無殞”的辨證思想，孤立地去評價藥物的毒性。因而制備符合中醫(yī)“證”的癌性腹水模型，比較峻下逐水類有毒中藥在生理與病理狀態(tài)下的毒副作用差異，探尋該類中藥藥效物質基礎及作用機制，可為該類有毒中藥臨床安全有效應用提供更為科學的依據[49]。

曹亮亮等[50]考察了不同提取部位的醋甘遂對癌性腹水模型大鼠的瀉水逐飲功效。結果表明，醋甘遂粉末與醋甘遂的混合提取物（醇提取與水提取物）對癌性腹水模型大鼠均有較顯著的瀉水逐飲作用，醋甘遂二萜類成分可能是其活性作用成分。Zhang Y等[51-52]研究發(fā)現，雖然甘遂、京大戟與甘草的配伍屬于“中藥十八反”的范疇，但甘遂和甘草以1 ∶ 0.39的比例組合可通過調節(jié)ADRB1-PIK3CG-血管加壓素V2受體（AVPR2）信號軸，在一定程度上減少癌性腹水；而大戟和甘草以1 ∶ 2的比例配伍，可能通過靶向酪氨酸相關激酶（Frk）-尿苷酸解離抑制因子（Arhgdib）-磷酸肌醇-5-磷酸酶（Inpp5d）- AVPR2-水通道蛋白4（Aqp4）信號軸，對癌性腹水發(fā)揮治療作用，這一作用與調節(jié)加壓素介導的水再吸收過程相關。

5.3 中藥復方的研究

中藥復方是祖國醫(yī)學遺產中的寶貴經驗之一，對于癌性腹水的治療，中藥復方通過方中藥物的配伍取得了良好的臨床療效，且不良反應小。而在非臨床藥物評價中，只有將特定功效的復方與證候病理模型二者結合，才能真實反映復方的治療作用[53]。

石躍進[40]研究發(fā)現，中藥復方加味五苓散用于S180腹水模型小鼠，能通過提高小鼠外周血中白細胞介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）的水平，從而抑制癌性腹水的增長。張瑛男[54]研究發(fā)現，加味消水方用藥前后，S180腹水模型小鼠的腹圍明顯降低，說明加味消水方有消腹水、利尿的作用，對緩解小鼠腹水癥狀的效果較好。蔚林蘭等[55]研究發(fā)現，水律湯（由水律草、土茯苓、北三七、螻蛄等組成）能使H22肝癌腹水模型小鼠尿中鈉、鉀、氯離子排出增加，減輕水鈉潴留，這可能是水律湯消除腹水的作用機制之一。王茜等[56]研究發(fā)現，醋甘遂與炙甘草以1 ∶ 15的比例配伍的甘遂半夏湯對癌性腹水模型大鼠可能有較好的利水及抗細胞因子作用。熊忠太等[57]研究發(fā)現，調營飲能明顯促進S180肝癌腹水模型小鼠腹膜淋巴孔開放面積的增大、周長和分布密度的增加，這可能是其消除腹水的作用機制之一。張萍等[58]基于“軟肝消水方”組方基礎（甘遂、三七、肉桂等，此組方體現了中醫(yī)“以攻為主、攻補兼施”的施治理念），利用現代制劑技術，開發(fā)出方便臨床使用的巴布劑型，并以腹水模型動物驗證其消退腹水的作用。結果表明，軟肝消水巴布劑對S180腹水模型小鼠有明顯的治療作用，且在適當劑量下療效顯著、毒副作用較低；其可能是通過改善肝腎功能、調節(jié)體內滲透壓及電解質平衡、調節(jié)活性因子水平等途徑實現的上述作用。李航森等[59]探究十棗湯對EAC腹水模型小鼠的生存期和腹水產生的影響，結果發(fā)現十棗湯能顯著延長小鼠生存期、減緩腹水產生等。楊賽琳等[60]建立H22荷瘤小鼠癌性腹水模型，探討人參二苓湯有效部位灌胃給藥對癌性腹水的療效以及相關機制，結果發(fā)現人參二苓湯能夠提高H22腹水模型小鼠的生存質量，抑制腹水中VEGF、MMP-2和MMP-9的表達，從而抑制H22荷瘤小鼠的癌性腹水。

6 結語

癌性腹水的病因復雜，至今尚未完全闡明，目前臨床多以利尿、腹腔反復穿刺抽液等方法治療，但療效并不理想。近年來中醫(yī)藥治療癌性腹水顯示出療效較好、價格低廉、副作用小等優(yōu)點，逐漸為大多數患者所接受，因此治療癌性腹水的高效低毒的中藥已成為近年來研究的重點和熱點。臨床上癌性腹水大多呈腹腔擴散方式轉移，而癌性腹水動物模型能恰當地模擬此病理過程，有助于開展中藥治療方法的相關基礎研究。因此，在研究與揭示中藥治療癌性腹水的作用機制中，動物模型的建立和應用顯得尤為關鍵。然而，國內外關于癌性腹水實驗動物模型的建立方法有限，使得中藥治療癌性腹水的研究受到限制。本文綜述了常用的4種癌性腹水實驗動物模型，其制備方法基本相同，多采用腹腔注射癌細胞株，操作簡單，成模率高。4種腹水型瘤細胞株有各自的特點，可根據實驗需要進行選擇。但癌性腹水證候復雜多變，本文列出的4種模型遠不能滿足中醫(yī)藥的研究，因此還需要進一步深入探索建立與中醫(yī)證候相結合的新的癌性腹水動物模型，為中藥治療癌性腹水的機制研究提供更多的選擇。

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（收稿日期：2017-10-07 修回日期：2018-01-26）

（編輯：段思怡）