麥胚凝集素修飾的長春瑞濱陽離子脂質體的處方優選及細胞毒性試驗

肖瑤 王鑫 符敏 劉晶晶 李學濤 程嵐

中圖分類號 R943 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）05-0611-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.09

摘 要 目的：制備麥胚凝集素（WGA）修飾的長春瑞濱（VRB）陽離子脂質體（WGA-VRB陽離子脂質體），優化處方并進行細胞毒性試驗。方法：以磷脂、膽固醇為輔料，以3β-[N-（N′ -N′ -二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基]膽固醇鹽酸鹽（DC-Chol）為陽離子材料，以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）為長循環鏈，采用薄膜分散法及硫酸銨梯度法制備WGA-VRB陽離子脂質體。以包封率為指標，采用星點設計-響應面法優化處方中DC-Chol、膽固醇和VRB用量。測定所制VRB脂質體和WGA-VRB陽離子脂質體中VRB含量，比較二者和空白陽離子脂質體作用于人乳腺癌細胞MCF-7和人非小細胞肺癌細胞A549后對細胞存活率的影響。結果：5 mL WGA-VRB陽離子脂質體的最優處方為磷脂22 mg、膽固醇12 mg、DC-Chol 8 mg、VRB 0.5 mg，其包封率為（92.24±1.21）%（n=3），與預測值的相對誤差為5.3%。VRB脂質體和WGA-VRB陽離子脂質體中VRB含量分別為（96.01± 3.26）、（93.39±1.59） μg/mL（n=3）；與空白陽離子脂質體和VRB脂質體比較，WGA-VRB陽離子脂質體可明顯降低MCF-7、A549細胞的存活率（P<0.05）。結論：成功制得WGA-VRB陽離子脂質體，其對MCF-7、A549細胞存活的抑制作用強于VRB脂質體。

關鍵詞 麥胚凝集素；長春瑞濱；陽離子脂質體；處方優選；星點設計-響應面法；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Wheat germ agglutinin （WGA） modified vinorelbine （VRB） cationic liposomes （WGA-VRB cationic liposomes）， and to optimize the formulation and conduct cytotoxicity test. METHODS： Thin-film diffusion and ammonium sulfate gradient method were used to prepare WGA-VRB cationic liposomes using phospholipid and cholesterol as excipient， 3β-[N-（N′ -N′ -dimethyl aminoethane）-carbamoyl] cholesterol hydrochloride （DC-Chol） as cationic material， distearoyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol 2000 （DSPE-PEG2000） as long cycle chain. Using encapsulation rate as index， central composite design-response surface methodology was used to optimize the amount of DC-Chol， cholesterol and VRB. The contents of VRB in VRB liposomes and WGA-VRB cationic liposomes were determined. The effects of them and blank cationic liposomes on survival rates of human breast cancer cell MCF-7 and human non-small cell lung cancer cells A549 were compared. RESULTS： The optimal formulation of 5 mL WGA-VRB cationic liposomes was as follows as phospholipid 22 mg， cholesterol 12 mg， DC-Chol 8 mg， VRB 0.5 mg. Encapsulation rate of the liposomes was （92.24±1.21）%（n=3）， relative error of which to predicted value was 5.3%. The contents of VRB in VRB liposomes and WGA-VRB cationic liposomes were （96.01±3.26），（93.39±1.59） μg/mL（n=3）. Compared with blank cationic liposomes and VRB liposomes， WGA-VRB cationic liposomes could significantly reduce survival rate of MCF-7 and A549. CONCLUSIONS： WGA-VRB cationic liposomes are prepared successfully. Inhibitory effect of WGA-VRB cationic liposomes on MCF-7 and A549 cell survival is stronger than that of VRB liposomes.

KEYWORDS Wheat germ agglutinin； Vinorelbine； Cationic liposomes； Formulation optimization； Central composite design- response surface methodology； Content determination

麥胚凝集素（WGA）是從小麥胚芽中提取的一種能與專一性糖結合、促進細胞凝集的二聚體蛋白質。研究表明將其與藥物或載體結合，可借助凝集素對癌細胞的親和作用增強抗癌活性[1]。脂質體是由磷脂雙分子層組成的類生物細胞膜結構，有降低藥物不良反應、提高藥物體內靶向性的優點[2]。但普通脂質體體內循環周期短、主動靶向性弱，限制了脂質體的進一步應用[3-4]。研究發現，與正常細胞相比，腫瘤細胞膜表面通常帶有較多的負電荷[5]。陽離子脂質體是利用陽離子磷脂材料制備成表面帶有正電荷的靶向給藥制劑[6]，陽離子脂質體可通過與腫瘤細胞膜的靜電吸附作用提高藥物的主動靶向效果。長春瑞濱為人工半合成類生物堿，廣泛應用于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴癌、食管癌等研究[7]。本課題制備WGA修飾的長春瑞濱（VRB）陽離子脂質體（WGA-VRB陽離子脂質體），通過凝集素與腫瘤細胞的主動親和作用[8]以及陽離子脂質體與腫瘤細胞膜的靜電吸附作用來增強VRB對腫瘤細胞的細胞毒性。采用星點設計-響應面法優選WGA-VRB陽離子脂質體處方，測定脂質體中VRB的含量并比較VRB脂質體和WGA-VRB陽離子脂質體對人乳腺癌細胞MCF-7和人非小細胞肺癌細胞A549存活率的影響。

1 材料

1.1 儀器

FA1004電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；RE52CS旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；JY92-2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技公司）；PHS-25pH計（上海精密科學儀器公司）；20AT液相色譜儀與紫外檢測器（日本島津公司）；WJ-80B-Ⅱ二氧化碳細胞培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）；HBS-1096A酶標分析儀（南京德鐵實驗設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

WGA蛋白（瑞典Medicago公司，批號：050102100，含量：>98%）；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000，上海艾偉特醫藥科技有限公司）； VRB原料藥、VRB對照品（大連美侖生物技術有限公司，批號：MB20886、MB5301，純度：>98%、≥98%）；葡聚糖凝膠Sephadex G-50（北京索萊寶科技有限公司）；卵磷脂（日本NOF公司）；膽固醇（普邁生物科技公司）； 3β-[N-（N′ -N′ -二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基]膽固醇鹽酸鹽（DC-Chol，美國Avanti公司）；胎牛血清（FBS）和RPMI-1640培養液（北京邁晨科技有限公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；96孔細胞培養板（無錫耐思生物科技有限公司）；甲醇、氯仿、三乙胺、磷酸等均為分析純。

1.3 細胞

MCF-7細胞和A549細胞均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。

2 方法與結果

2.1 WGA-VRB陽離子脂質體的制備

以磷脂、膽固醇為輔料，以DC-Chol為陽離子材料，以DSPE-PEG2000為長循環鏈，采用薄膜分散法和硫酸銨梯度法制備WGA-VRB陽離子脂質體。取處方量磷脂、膽固醇、DC-Chol、DSPE-PEG2000，加氯仿溶解，40 ℃水浴旋轉蒸發形成均勻脂膜，加入250 mol/L （NH4）2SO4水溶液5 mL，超聲水化（功率180 W），然后超聲10 min（超聲時間與間歇時間各10 s，功率200 W），過0.22 μm微孔濾膜2次，過膜后密封于透析膜袋中（截留分子量12 000～14 000 Da），以磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH為7.2～7.4）為透析介質，透析3次，每次8 h，加入WGA 2 mg，室溫勻速攪拌2 h，得空白陽離子脂質體。空白陽離子脂質體中加入處方量的VRB原料藥，40 ℃水浴振搖20 min，即得。

2.2 VRB的含量測定

2.2.1 色譜條件 參考文獻[9]，色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.06 mol/L KH2PO4（0.3%三乙胺）（33 ∶ 67，V/V，磷酸調pH=4.0）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：267 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液的制備 取WGA-VRB陽離子脂質體1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇破乳定容，制成供試品溶液。取VRB對照品適量，甲醇溶解稀釋制成質量濃度分別為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL的系列標準溶液，作為對照品溶液。取空白陽離子脂質體1 mL，置于10 mL量瓶，甲醇定容，作為空白溶液。

2.2.3 系統適用性試驗 取供試品溶液、對照品溶液（0.1 mg/mL）及空白溶液各20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果顯示，VRB的出峰時間為7.9～8.1 min，空白溶液在此無色譜峰出現，可見空白脂質體對VRB的測定無干擾。理論板數按VRB峰計不低于3 000。

2.2.4 標準曲線的繪制 按“2.2.1”項下色譜條件，進樣測定“2.2.2”項下不同質量濃度的系列標準溶液的峰面積，以質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行回歸分析。得回歸方程為y=2 068.1x+31 671（r=0.999 9，n=6），結果表明，VRB檢測質量濃度在12.5～400 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.2.5 重復性試驗 取供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，重復5次，計算峰面積的RSD為1.27%（n=5），表明該方法重復性良好。

2.2.6 穩定性試驗 取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積，計算峰面積的RSD為1.62%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 取空白陽離子脂質體1 mL，于10 mL量瓶，加0.1 mg/mL VRB對照品溶液1 mL，甲醇定容制成質控樣品溶液，重復6次，進樣測定，記錄峰面積，計算平均加樣回收率為99.00%（RSD為1.10%，n=6）。

2.3 包封率的測定

取Sephadex G-50 2.0 g，于PBS中浸泡24 h，濕法裝柱（10 cm×1.5 cm）備用。取WGA-VRB陽離子脂質體0.5 mL，置于凝膠柱上方，以1.0 mL/min流速用PBS洗脫，收集乳光部分加PBS定容混勻。取WGA-VRB陽離子脂質體0.5 mL，加PBS定容至相同體積混勻。按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，重復3次，計算包封率（%）=（W后/W前）×100%，式中W后和W前分別為過柱后和過柱前脂質體中VRB的含量。

2.4 優化脂質體處方

根據單因素考察結果和文獻[10]，依據星點設計-響應面法設計原理選擇對陽離子脂質體包封率影響較大的3個因素即DC-Chol用量（X1）、膽固醇用量（X2）、VRB用量（X3）為因素，以包封率（Y）為指標，固定處方量為5 mL、磷脂為22 mg，確定各因素的用量范圍為：X1 4～12 mg，X2 4～12 mg，X3 0.2～0.6 mg，并分別設立3個水平設計試驗。因素與水平見表1，星點設計與結果見表2。

將表2中數據輸入Design-Expert 8.0.6.1軟件，擬合方程為Y=21.320 0-2.266 9X1+18.973 8X2-178.037 5X3+0.426 6X1X2+1.118 8X1X3+10.475 0X2X3-0.131 9X12-1.178 4X22+62.250 0X32（R=0.970 3，P<0.05），說明模型能夠很好地反映響應值的變化，可用于分析和預測WGA-VRB陽離子脂質體的最優處方。對上述擬合模型進行顯著性檢驗，結果顯示，X2和X22對Y有顯著影響（P<0.01）；X1、X3、X1X2、X2X3、X1X3對Y沒有顯著影響（P>0.05）。固定一個因素的水平為0，使用Design-Expert 8.0.6.1軟件生成其他因素對包封率的響應面圖和等高線圖，響應面圖見圖1，等高線圖見圖2。

從圖1和圖2可以看出，3個因素間沒有明顯的交互作用，在磷脂固定不變的情況下X1和X3對Y的影響不大，但X2對Y有顯著影響。因此結合實驗室脂質體處方考察經驗及脂質體制備的實際要求和脂質體性狀，確定最優處方為磷脂22 mg、DC-Chol 8 mg、膽固醇12 mg、VRB 0.5 mg，處方量為5 mL。根據最優處方制備3批WGA-VRB陽離子脂質體，測定包封率。結果顯示，3批樣品的包封率為（92.24±1.21）%，其與預測值（87.56%）的相對誤差為5.3%。表明該處方合理，方法可行。

2.5 脂質體中VRB的含量比較

2.5.1 脂質體的制備 按最優處方，根據“2.1”項下方法制備WGA-VRB陽離子脂質體，同法制備，不含DC- Chol和WGA的VRB脂質體。

2.5.2 VRB的含量測定 分別測定WGA-VRB陽離子脂質體和VRB脂質體中VRB的含量，各3批。結果顯示，WGA-VRB陽離子脂質體和VRB脂質體中VRB的含量分別為（93.39±1.59）、（96.01±3.26） μg/mL（n=3）。

2.6 脂質體的細胞毒性試驗

2.6.1 細胞培養 MCF-7細胞和A549細胞常規培養于RPMI 1640培養液（含10%FBS、100 ?g/mL青-鏈霉素）培養液中，于5% CO2的37 ℃培養箱中培養。

2.6.2 細胞存活率的測定 收集對數生長期MCF-7細胞和A549細胞（約2×104個/孔）接種于96孔培養板中，于培養箱中培養24 h。分別加入0（空白對照）、0.011、0.027、0.043、0.059、0.076、0.092、0.110 ?g/mL WGA-VRB陽離子脂質體或VRB脂質體，以空白陽離子脂質體為對照，繼續培養48 h。采用SRB法[11]測定細胞存活率，細胞存活率（%）=藥物處理后的光密度值/空白對照的光密度值×100%。結果顯示，與空白陽離子脂質體和VRB脂質體比較，WGA-VRB陽離子脂質體作用后細胞的存活率明顯降低（P<0.05）。3種脂質體作用后MCF-7、A549細胞存活率結果見圖3。

3 討論

星點設計-響應面法是目前常用的將數學和統計學相融合的試驗設計方法，將星點設計應用于脂質體處方優選的研究也不斷增多。脂質體研究中常常將膜材用量比例作為研究指標，本試驗在傳統脂質體處方基礎上，固定磷脂量，以膽固醇、DC-Chol、VRB用量為因素，脂質體包封率為指標優化了脂質體處方，最終確定制備WGA-VRB陽離子脂質體（5 mL）的最優處方為磷脂22 mg、DC-Chol 8 mg、膽固醇12 mg、VRB 0.5 mg。2015年版《中國藥典》有關脂質體包封率的要求為80%以上[12]，經驗證該陽離子脂質體最終處方的平均包封率為（92.24±1.21）%（n=3）。結果表明，該陽離子脂質體處方符合要求，并為該陽離子脂質體的進一步研究奠定了基礎。

VRB對腫瘤有較好的臨床治療效果，因毒副作用大，常將其制備成靶向制劑。脂質體是由磷脂和膽固醇組成的類細胞膜結構，因其具有可與細胞膜融合、體內可降解的特點被廣泛用于靶向給藥系統。脂質體作為一種安全穩定的載體形式，多用于基因靶向治療的研究中[13]。本課題在此基礎上引入陽離子材料，利用藥物與細胞膜表面負電荷的靜電吸附作用，增加其靶向性效果[14]。WGA可與腫瘤細胞表面的特定受體相結合，因此引入WGA修飾于脂質體表面。最終制備了理論上具有雙重靶向治療作用的WGA-VRB陽離子脂質體。通過細胞存活率的比較，評價了VRB脂質體和WGA-VRB陽離子脂質體對MCF-7、A549細胞的影響，結果顯示，WGA-VRB陽離子脂質體對MCF-7、A549細胞存活的抑制作用強于VRB脂質體。

參考文獻

[ 1 ] 段曉穎，賈慶涵，劉麗娜.苦參堿納米粒及其麥胚凝集素修飾產物的制備[J].中成藥，2017，39（1）：55-60.

[ 2 ] 何文，胡翠蘋，郭咸希. N-三甲基殼聚糖包覆水飛薊賓脂質體在小鼠體內的藥動學及靶向性[J].中國醫院藥學雜志，2016，36（3）：196-200.

[ 3 ] 喻樊，楊錦明，李金娟. PEG修飾β-谷甾醇制備新型絞股藍總皂苷長循環脂質體的研究[J].中國中藥雜志，2014，39（6）：997-1001.

[ 4 ] 袁端鋒，宗太麗，高會樂.穿膜肽TAT和腦腫瘤靶向肽T7雙修飾脂質體的制備和體外靶向性評價[J].藥學學報，2015，50（1）：104-110.

[ 5 ] 吳迪，趙穎，任會丹，等.陽離子抗癌肽Temporin-1CEa脂質體的構建及其體外抗乳腺癌活性評價[J].中國生化藥物雜志，2016，36（11）：22-26.

[ 6 ] 陳偉光，劉源崗，王士斌，等.陽離子脂質體共載siRNA與紫杉醇的制備與性能表征[J].科學通報，2013，58（11）：1014-1020.

[ 7 ] 馬一平.異長春花堿抑制人乳腺癌細胞轉移侵襲的作用及其機制[J].中草藥，2013，44（13）：1786-1792.

[ 8 ] 王艷紅，王曉敏，劉爽.星點設計-響應面法優化WGA修飾柔紅霉素-粉防己堿脂質體處方[J].食品與藥品，2016，18（4）：229-234.

[ 9 ] 楊雯姝，邱利焱，金一. RP-HPLC法測定脂質體中重酒石酸長春瑞濱的含量[J].藥物分析雜志，2006，26（5）：646-648.

[10] 姜英，王曉敏，王艷紅.星點設計-效應面法優化轉鐵蛋白修飾粉防己堿與硫酸長春新堿脂質體的處方[J].中國藥房，2015，26（31）：4399-4401.

[11] SHI JF，SUN MG，LI XY，et al. A combination of targeted sunitinib liposomes and targeted vinorelbine liposomes for treating invasive breast cancer[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology，2015，11（9）：1568-1582.

[12] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S]. 2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：371-374.

[13] 趙軼男，劉安，付瑩，等.陽離子脂質體基因載體的穩定性研究[J].大連民族大學學報，2017，19（3）：202-206.

[14] 陳偉光，劉源崗，王士斌，等.陽離子脂質體共載基因與化療藥物用于癌癥治療的研究進展[J].藥學學報，2012，47（8）：986-992.

（收稿日期：2017-08-29 修回日期：2017-11-09）

（編輯：鄒麗娟）