姜黃素—PLGA納米粒溫敏原位凝膠的制備及其在兔眼房水中的藥動學研究

李林芝 劉梅 常穎

院藥劑科，重慶 400021）

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）05-0640-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.16

摘 要 目的：制備載姜黃素（CUR）-聚乳酸/羥基乙酸共聚物（PLGA）納米粒的溫敏原位凝膠（CUR-PLGA-GEL），研究其在兔眼房水中的藥動學特征。方法：采用改良的乳化-溶劑揮發(fā)法制備CUR-PLGA納米粒，以泊洛沙姆 407（P407）和泊洛沙姆 188（P188）為凝膠基質，冷溶法制備CUR-PLGA-GEL，高效液相色譜法測定凝膠中CUR水平，并考察其對兔眼的刺激性（5只兔左、右眼自身對照，采用Draize測試進行刺激性評分）；10只新西蘭白兔隨機分為2組，每組5只，左眼分別滴加CUR-PLGA-GEL或CUR混懸液（含CUR 8 mg），分別測定給藥前及給藥后1、2、4、6、8、10、12、24 h時兔眼房水中CUR的濃度；采用DAS 2.0 軟件計算藥動學參數。結果：成功制備了CUR-PLGA-GEL，其兔眼刺激性評分總分為0分，表明其對兔眼刺激性小。兔眼房水中，CUR-PLGA-GEL的cmax和AUC0-24 h分別是CUR混懸液的2.48和2.71倍。結論：制備的CUR- PLGA-GEL可用于眼部給藥，可提高CUR在眼部的利用度。

關鍵詞 姜黃素；聚乳酸/羥基乙酸共聚物納米粒；溫敏原位凝膠；眼部給藥；刺激性；兔；房水；藥動學

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare curcumin （CUR）-Poly （lactic-co-glycolic acid） （PLGA） nanoparticles （CUR-PLGA） thermosensitive in-situ gel （CUR-PLGA-GEL）， and to study pharmacokinetic characteristics of it in aqueous humor of rabbits. METHODS： CUR-PLGA was prepared with modified emulsion-solvent evaporation method. CUR-PLGA-GEL was prepared by cold-dissolving method using poloxamer407 （P407） and poloxamer 188 （P188） as gel matrix. The level of CUR in gel was determined by HPLC， and the irritation of it to rabbit eyes was investigated （self-control of left and right eyes of 5 rabbits were taken， while the Draize test was used to evalvate the irritation）. 10 New Zealand white rabbits were randomly divided into 2 groups， with 5 rabbits in each group. Left eyes were given CUR-PLGA-GEL and CUR suspension （containing CUR 8 mg）， respectively. The concentrations of CUR in aqueous humor of rabbits were determined before medication and 1， 2， 4， 6， 8， 10， 12， 24 h after medication. The pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS 2.0 software. RESULTS： CUR-PLGA-GEL was successfully prepared and the total score of irritation was 0， which indicated irritative to rabbits. In aqueous humor of rabbits， cmax and AUC0-24 h of CUR-PLGA-GEL were 2.48 and 2.71 fold of CUR suspension. CONCLUSIONS： Prepared CUR-PLGA-GEL can be used for ophthalmic delivery and can improve the utilization of CUR in the eye.

KEYWORDS Curcumin； Poly （lactic-co-glycolic acid） nanoparticles； Thermosensitive in-situ gel； Ophthalmic delivery； Irritation； Rabbit； Aqueous humor； Pharmacokinetics

糖尿病視網膜病變（Diabetic retinopathy，DR）在糖尿病患者中是最常見的并發(fā)癥之一，是導致中老年糖尿病患者失明的主要原因[1]。姜黃素（Curcumin，CUR）對DR具有較好的治療效果，并在糖尿病患者及糖尿病模型大鼠中均已得到證實[2]，可通過抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡、保護視網膜細胞等作用改善糖尿病引起的眼部病理改變[3-7]，在眼科具有良好的應用前景。局部給藥是目前常用的治療DR的手段之一，但常規(guī)給藥后藥物在眼部的生物利用度極低[7]。用于眼部給藥的溫敏原位凝膠是一種新型眼部給藥系統[8]，該劑型制劑可根據環(huán)境溫度的變化發(fā)生轉變，由液體制劑轉變成半固體凝膠，使得制劑的黏度增加，藥物在眼部的滯留時間延長，進而達到提高藥物在眼部生物利用度的目的[9]。因此，本研究以聚乳酸/羥基乙酸共聚物（PLGA）和泊洛沙姆為載體材料，制備了CUR-PLGA納米粒溫敏原位凝膠（CUR-PLGA-GEL），旨在提高CUR在眼部的滯留時間，進而提高CUR的生物利用度，為DR的給藥新劑型的研發(fā)提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

UV-2501紫外分光光度計（日本島津公司）；JA 1003精密電子天平（上海方瑞儀器有限公司）；SM-1000C超聲波納米材料分散器（南京舜瑪儀器設備有限公司）；Zetasizer Nano納米粒度儀（英國Malvern公司）；1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）。

1.2 藥材與試劑

CUR、聚乙烯醇原料藥（美國Sigma公司，批號：458377、16796TJ，純度：≥99.5%、≥99%）；PLGA（長春圣博瑪生物材料有限公司，50 ∶ 50，V/V）；泊洛沙姆407（P407）、泊洛沙姆188（P188）均購自德國Basf公司，其他試劑均為分析純。

1.3 動物

新西蘭白兔10只，體質量2～2.5 kg，3月齡，♀♂各半，健康無眼疾，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，使用許可證號：SYXK（渝）2017-0023。

2 方法與結果

2.1 CUR-PLGA納米粒的制備

采用改良的乳化-溶劑揮發(fā)法制備CUR-PLGA納米粒[10-11]，具體操作如下：按質量比為5 ∶ 1精密稱取PLGA和CUR，共同溶于有機相二氯甲烷溶液中。以3%聚乙烯醇（pH 1.2）為水相，將有機相加入水相后，高速（15 000 r/min）攪拌3 min，使用超聲波納米材料分散器超聲200 s后，室溫下置于磁力攪拌器上攪拌4 h以揮發(fā)有機溶劑。在4℃條件下離心（離心半徑為5 cm，18 000 r/min）20 min，收集納米粒，用超純水洗滌后冷凍干燥，即得CUR-PLGA納米粒凍干粉。精密稱取10 mg CUR-PLGA納米粒凍干粉置于10 mL 量瓶中，以丙酮為溶劑，超聲使納米粒完全溶解，定容，稀釋約15倍后以紫外分光光度法測定其吸光度值，以粗略計算CUR-PLGA納米粒中CUR的載藥量（PLGA中所含藥物量/PLGA的總量×100%）。經測定，制得的CUR-PLGA納米粒平均載藥量為（16.1±1.1）%，換算為質量濃度約為0.16 mg/mL，符合其20 mg/L即可發(fā)揮較好的藥理作用的研究結果，給藥劑量合理。

取適量CUR-PLGA納米粒，超純水稀釋后，采用納米粒度儀測定納米粒的粒徑大小及分布。結果顯示，CUR-PLGA納米粒的平均粒徑為381 nm。CUR-PLGA納米粒粒徑分布圖見圖1。

2.2 CUR-PLGA-GEL的制備

采用冷溶法[12]制備CUR-PLGA-GEL溶液，具體操作如下：精密稱取10 mg CUR-PLGA納米粒溶于10 mL生理鹽水中，于磁力攪拌器攪拌下按處方比例緩慢加入0.419 g P188和2.500 g P407，攪拌1 h，于4 ℃冰箱中靜置過夜，即得。

2.3 眼部刺激性實驗

將5只新西蘭白兔置于兔箱中60 min使其適應實驗環(huán)境，在其右眼滴入50 μL CUR-PLGA-GEL，左眼作為對照，滴加等體積生理鹽水。滴入制劑后，將白兔眼瞼閉合數秒，分別在給藥0、0.08、0.17、0.5、1、6、12、24、48、72 h后觀察白兔雙眼角膜、虹膜、結膜、分泌物的變化和結膜水腫情況，根據Draize測試[13]對制劑的刺激性進行評分。結果，給藥后在各時間點白兔雙眼的結膜均無腫脹、充血發(fā)生，眼部無明顯異常分泌物，角膜無渾濁出現，鞏膜未出現異常反應，制劑對眼部的刺激性評分總分為0，說明制劑溫和、刺激性小，作為眼部給藥安全性高、可行性好。

2.4 CUR含量檢測方法的建立

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18（20 cm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-超純水（含1%檸檬酸，73 ∶ 27，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：423 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：1 μL。

2.4.2 房水樣品處理 取各時間點房水樣品200 μL，加入乙酸乙酯2 mL、0.1 mmol/L 的鹽酸20 μL，渦旋混勻后離心（離心半徑為5 cm，12 000 r/min，下同）10 min，取上清液減壓干燥，用50 μL 流動相溶解混勻殘留物，再次離心10 min后取上清液，進樣測定。

2.4.3 專屬性考察 分別取兔空白房水200 μL，質量濃度為375 ng/mL 的CUR甲醇溶液、兔空白房水+質量濃度為375 ng/mL 的CUR甲醇溶液、房水樣品（給藥后2 h），按 “2.4.2”項下方法處理后，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。結果，兔空白房水樣品在2.2 min左右有溶劑峰出現，而CUR在4.9 min附近出峰，兔房水中的內源性物質不干擾CUR的測定，方法專屬性較強。色譜圖見圖2。

2.4.4 線性關系考察 取兔空白房水200 μL，加入CUR甲醇溶液制成質量濃度為11.718 75、23.437 5、46.875、93.75、187.5、375、750、1 500、3 000 ng/mL的系列標準溶液，按照“2.4.2”下方法處理后，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。以CUR質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y=0.230 6x+0.039 2（r=0.998 2），表明CUR在質量濃度為11.718 75～3 000 ng/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4.5 精密度考察 取兔空白房水200 μL，加入適量CUR甲醇溶液，分別制成CUR低、中、高質量濃度（11.718 75、375、3 000 ng/mL）的樣品，經“2.4.2”項下方法處理后，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，得峰面積，日內平行進樣5次，考察日內精密度；連續(xù)進樣5 d，每天1次，考察日間精密度。結果，低、中、高質量濃度樣品日內精密度的RSD分別為1.88%、3.32%、2.25%（n=5），日間精密度的RSD分別為4.92%、3.12%、1.30%（n=5），均符合相關規(guī)定。

2.4.6 穩(wěn)定性考察 制備質量濃度為375.00 ng/mL的CUR房水樣品，按“2.4.2”項下方法處理后，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣檢測，結果，穩(wěn)定性試驗的RSD為2.71%（n=6），表明供試品12 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.7 提取回收率考察 按“2.4.1”項下色譜條件測定質量濃度分別為11.718 75、375、3 000 ng/mL的CUR對照品溶液，得峰面積A1。同時取200 μL兔空白房水，加入適量CUR甲醇溶液，制成CUR質量濃度分別為11.718 75、375、3 000 ng/mL的房水樣品，按“2.4.2”項下方法處理后，進樣測得峰面積A2。按A2/A1×100%計算提取回收率。結果，低、中、高質量濃度樣品的平均提取回收率分別為89.05%、88.88%、82.28%（RSD分別為8.54%、2.98%、2.49%，n=3），表明本方法準確度良好。

2.4.8 方法回收率考察 取200 μL兔空白房水，加入適量CUR，制成CUR質量濃度分別為11.718 75、375、 3 000 ng/mL的樣品溶液，經“2.4.2”項下方法處理后，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，得峰面積，代入回歸方程中，計算出CUR濃度。方法回收率=測得樣品質量濃度/加入樣品質量濃度×100%。結果，低、中、高質量濃度樣品的平均方法回收率分別為91.56%、83.12%、87.04%（RSD分別為6.67%、3.31%、0.27%，n=3），表明方法準確度良好。

2.5 藥動學實驗

10只新西蘭白兔隨機分為2組，每組5只。左眼分別滴加CUR-PLGA-GEL、CUR混懸液（CUR-SUS，稱取一定量CUR混懸于生理鹽水中，振蕩混勻制成CUR質量濃度為0.16 mg/mL即可），含CUR 8 mg，給藥劑量根據預實驗確定。給藥時，略微拉開白兔下眼瞼，滴入制劑后放開，輕壓內眥使眼睛閉合15 s，防止制劑溢出。分別于給藥前及給藥后1、2、4、6、8、10、12、24 h取房水200 μL，按 “2.4.2”項下方法處理后，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。藥-時濃度曲線見圖3。采用DAS 2.0軟件計算藥動學參數，結果見表1。

結果，CUR-PLGA-GEL給藥后的房水中CUR的藥物濃度明顯高于CUR-SUS。從藥動學參數結果來看，CUR-PLGA-GEL的cmax和AUC0-24 h分別是CUR混懸液的2.48和2.71倍。說明CUR-PLGA-GEL明顯提高了CUR在房水中的濃度，且CUR-PLGA-GEL的t1/2也長于CUR-SUS，說明CUR-PLGA-GEL在眼部的代謝較慢，其延長了CUR在眼部的滯留時間，其在眼部的吸收更符合一級吸收模型。

3 討論

DR作為糖尿病并發(fā)癥中最嚴重的疾病困擾著眾多糖尿病患者及醫(yī)務工作者。雖然激光光凝治療被認為是治療DR最有效的方法，但此療法對部分患者的療效并不理想，而局部給藥則是較為常用的一種給藥途徑[14]。研究表明，藥物可以通過抗炎、抗氧化應激等作用改善DR的病理改變[15]。但由于眼部特殊的生理結構和其特有的一些保護機制的存在，使得普通的液體制劑在眼部迅速被排泄，滯留時間短，導致藥物在眼部的利用度較低，療效不理想[16]。為解決這一難題，近年來科研工作者研發(fā)出了多種新型眼部給藥系統，常用的劑型有凝膠、納米粒、植入劑等。溫敏原位凝膠作為凝膠給藥系統中一種新劑型，由于其可對環(huán)境的改變產生響應，并且刺激性、毒性較低，而成為極具應用前景的眼部給藥系統載體。

CUR作為一種具有多種藥理活性的中藥成分成為目前研究的熱點，前期研究證實，CUR可以改善DR模型大鼠中視網膜的病理改變，抑制大鼠視網膜神經細胞凋亡而發(fā)揮對糖尿病眼底病變的防治作用，但由于其理化性質的不穩(wěn)定性使其臨床應用受到極大的限制。本研究的前期工作將CUR直接制備成溫敏原位凝膠，但在考察制劑的穩(wěn)定性時發(fā)現制劑的穩(wěn)定性較差，48 h后凝膠制劑就會出現沉淀，因此本研究先將CUR制備成CUR-PLGA納米粒，再制成CUR-PLGA-GEL，旨在提高制劑的穩(wěn)定性及延長CUR在眼部的滯留時間，進一步提高CUR在眼部的利用度。PLGA是一種生物可降解聚合物材料，具有良好的生物相容性，可用于多種不同性質藥物制劑的制備，包括緩釋制劑、靶向制劑等[17]，因此本研究選擇PLGA作為載體材料，制備成CUR-PLGA納米粒，以提高藥物的穩(wěn)定性。CUR是一類酸性酚類物質，在堿性條件下會發(fā)生電子云偏離的共軛效應，變?yōu)榧t色，因此在制備過程中要注意保持反應體系的酸性條件。

本研究中的刺激性考察結果發(fā)現，CUR-PLGA-GEL的刺激性小，說明該制劑用于眼部給藥是安全可行的。本研究建立了CUR在兔房水中的高效液相色譜檢測方法和樣品處理方法，方法學考察證明該法可行性良好、提取回收率和方法回收率較高、精密度良好，可用于CUR的測定。在制劑的眼部利用度實驗中發(fā)現，將CUR制備成CUR-PLGA-GEL后，可以明顯提高CUR在房水中的cmax，并且延長藥物的t1/2，結果證明，CUR-PLGA- GEL可延長CUR在眼部的滯留時間并提高其眼部利用度。本研究在后續(xù)的工作中會建立DR模型，進一步研究該制劑對于該疾病的作用。

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（收稿日期：2017-07-29 修回日期：2018-01-05）

（編輯：劉明偉）