澤瀉湯加味方對高脂血癥模型大鼠肝組織中水通道蛋白8的影響

張睦清 韓雪 段思明 張一昕 王亞芬 張納博 王彥蕊

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）05-0651-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.19

摘 要 目的：觀察澤瀉湯加味方對高脂血癥模型大鼠肝組織中水通道蛋白8（AQP8）表達的影響，探討該方防治高脂血癥的機制。方法：將60只大鼠隨機分為空白對照組（蒸餾水）、模型組、陽性對照組（辛伐他汀1.89 mg/kg）和澤瀉湯加味方高、中、低劑量組（29.56、14.78、7.39 g/kg，以生藥量計），每組10只。除空白對照組大鼠給予正常飲食外，其余各組大鼠均給予高脂飼料以復制高脂血癥模型，并于造模同時每天灌胃給藥1次，連續給藥5周。給藥結束后，檢測大鼠血清中三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）含量，觀察大鼠肝組織病理形態學變化，并檢測大鼠肝組織中AQP8 mRNA和蛋白表達水平。結果：與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C含量顯著升高（P<0.05或P<0.01），血清中HDL-C含量顯著降低（P<0.01），肝組織出現細胞排列不整齊、肝血竇充血水腫等病理學變化，肝組織中AQP8 mRNA和蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標均顯著改善（P<0.05或P<0.01），肝組織的結構趨于正常、脂肪變性明顯減輕。結論：澤瀉湯加味方可能通過下調肝組織中AQP8 mRNA及蛋白的表達，發揮其對高脂血癥的防治作用。

關鍵詞 澤瀉湯加味方；高脂血癥；水通道蛋白8；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe the effects of Modified Rhizoma Alismatis decoction on the expression of aquaporin 8 （AQP8） in liver tissue of hyperlipemia model rats， and to investigate the mechanism of preventing and treating hyperlipemia. METHODS： Total of 60 rats were randomly divided into blank control group （distilled water）， model group， positive control group （simvastatin 1.89 mg/kg） and modified Rhizoma Alismatis decoction high-dose， medium-dose and low-dose groups （29.56， 14.78， 7.39 g/kg， calculated by crude drug）， with 10 rats in each group. Those groups were given high-fat diet to induce hyperlipemia model and given relevant medicine intragastrically once a day for consecutive 5 weeks except that blank control group was given normal diet. After administration， the serum contents of TG， TC， HDL-C and LDL-C in rats were detected， and the pathomorphology changes of liver tissue were observed； the mRNA and protein expression of AQP8 in liver tissue were detected. RESULTS： Compared blank control group， the serum contents of TG， TC and LDL-C in model group were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the serum content of HDL-C was decreased significantly （P<0.01）； pathological changes were found in liver tissue， such as irregular cell arrangement and hepatic sinusoidal hyperemia and edema； mRNA and protein expression of AQP8 in liver tissue were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， above indexes of treatment groups were improved significantly （P<0.05 or P<0.01）； the structure of liver tissue tended to be normal and the fatty degeneration was obviously alleviated. CONCLUSIONS： Modified Rhizoma Alismatis decoction can regulate the mRNA and protein expression of AQP8 in liver tissue so as to play the effects on the prevention and treatment of hyperlipidemia.

KEYWORDS Modified Rhizoma Alismatis decoction； Hyperlipidemia； Aquaporin 8； Rat

高脂血癥（Hyperlipidemia，簡稱為“HYP”）是導致心腦血管疾病獨立而重要的危險因素之一，積極有效地調節血脂是防治心腦血管疾病的重要途徑[1]。常用的心腦血管治療藥物有他汀類、貝特類等，雖療效顯著，但因副作用較多而限制了其臨床應用[2]。近年來，中醫藥在防治HYP方面顯示出了多途徑、多靶點、整體調節、不良反應較少的優勢。中醫根據HYP臨床表現特點，將其歸屬于“痰濁”“血瘀”等范疇，而脾失健運、濕聚痰生、壅滯血脈為其主要發病機制[3]，健脾祛濕消痰為其有效治法。

澤瀉湯出自張仲景《金匱要略》，由澤瀉、白術兩味中藥材組成，方中澤瀉功利水濕、消痰濁，為君藥；白術健脾益氣、燥濕利水以治生痰之源，為臣藥。澤瀉湯加味方是在澤瀉湯的基礎上增加了一味中藥荷葉。荷葉升清降濁、祛濕利尿，三藥合用，標本兼顧，共奏祛濕化痰、健運脾胃之功[4]。水通道蛋白（AQPs）是一種跨膜轉運蛋白[5]，參與液體的吸收、分泌及調節細胞內外水液平衡的生理病理過程，對機體的水液平衡具有重要的調節作用[6]。水液代謝失常引起的濕聚生痰是HYP的主要病機，而AQPs對調節水液代謝發揮著重要的作用，故筆者推測AQPs的表達失調與HYP發病具有密切的相關性。目前發現的AQPs有13個亞型， 其中，AQP8主要存在于肝細胞中，且表達量最高[7]。因此，本研究通過觀察澤瀉湯加味方對HYP大鼠肝細胞中AQP8 mRNA和蛋白表達的影響，探討其防治HYP的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

PE 9600型聚合酶鏈式反應（PCR）擴增儀（美國PE公司）；Humalyzer 2000型半自動生化分析儀（德國 Merck公司）；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCP-31CN型電泳槽（北京六一生物科技有限公司）；GDS-8000 System型UVP凝膠成像系統 （美國Thermo公司）；WSE-4040型半干轉膜儀系統（日本Atto公司）；Spectronic? Genesystm型紫外-可見分光光度計（美國MiltonRoy公司）； BX51T-PHD-J11型全能顯微鏡（日本 Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

澤瀉湯加味方組成為澤瀉顆粒（批號：5073461，規格：每袋1.5 g，相當于臨床使用量飲片10 g）50 g、白術顆粒（批號：5063421，規格：每袋3.0 g，相當于臨床使用量飲片10 g）20 g、荷葉顆粒（批號：505037T，規格：每袋0.5 g，相當于臨床使用量飲片10 g）10 g，均購自廣東一方制藥有限公司，臨用時用100 ℃蒸餾水充分溶解；辛伐他汀片（石藥控股集團有限公司，批號：380150701，批準文號：國藥準字H20093007，規格：20 mg/片，加至0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液中攪拌均勻）；膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號：201501、201411）；高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C，長春匯力生物技術有限公司，批號：2015025、2015055）；總RNA提取試劑、cDNA合成試劑盒、DNA分子量標準物（Marker，日本Takara公司，批號：9108、6210A、DL2000）； AQP8兔抗鼠免疫球蛋白（IgG）多克隆抗體（美國Origene公司，批號：TA323215s）；兔免疫組化（SP）試劑盒、二喹啉甲酸（DAB）顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：16159A07、K164920D）；β-肌動蛋白（β-actin）引物序列設計來源于NCBI Reference Sequence： NM_031144.3，AQP8引物序列設計來源于NCBI Reference Sequence： NM_019158.2。

1.3 動物

健康清潔級SD大鼠60只，♂，體質量160～180 g，由河北省實驗動物中心提供（生產合格證號：1511283）。購入后飼養于清潔級實驗室內，適應性飼養1周后用于實驗。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只SD大鼠按體質量分層原則隨機分為6組，分別為空白對照組、模型組、陽性對照組和澤瀉湯加味方低、中、高劑量組，每組10只。除空白對照組大鼠喂飼普通飼料外，其余各組大鼠均喂飼高脂飼料（組成比例為膽固醇1.5%、豬油10%、豬膽酸鈉0.5%、普通飼料88%，由河北省實驗動物中心加工）復制HYP大鼠模型[8]。從造模第1天起，空白對照組與模型組大鼠灌服蒸餾水，陽性對照組灌服1.89 mg/kg辛伐他汀（根據臨床等效劑量換算而得），澤瀉湯加味方高、中、低劑量組大鼠分別灌服以生藥量計7.39、14.78、29.56 g/kg藥液（根據成人臨床用量的1、2、4倍換算而得），各組大鼠均按1 mL/100 g給藥，每天給藥1次，連續給藥5周。

2.2 樣本采集及處理

末次給藥后大鼠禁食不禁水24 h，麻醉后股動脈取血，室溫靜置30 min，在4 ℃條件下以離心半徑為10 cm、3 000 r/min離心10 min，采集血清置于EP 管中，待檢。迅速剖腹取出肝組織，于肝最大葉處取兩塊適宜大小的肝組織液氮保存，以觀察AQP8 mRNA表達。再取1 cm×1 cm×0.5 cm大小的肝組織，置于4%多聚甲醛液中固定，以觀察肝組織病理學變化。

2.3 血脂指標檢測

采用半自動生化分析儀檢測大鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C含量。

2.4 肝組織病理學觀察

將4%多聚甲醛固定的肝組織常規脫水，石蠟包埋，切片（厚度為3 μm），行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察肝組織的病理形態學變化。

2.5 肝組織中AQP8 mRNA表達

采用反轉錄PCR（RT-PCR）法檢測肝組織中AQP8 mRNA表達。取肝組織100 mg，加入到1 mL Trizol試劑中，于冰上勻漿，提取總RNA，紫外-可見分光光度計測量其濃度和純度，電泳檢測其完整性。調整RNA質量濃度為 1 ?g/?L，將其反轉錄成 cDNA。擴增引物序列：AQP8上游引物為5′ -ATATGTCTGGGGAGCAGACGC-3′ ，下游引物為5′ -GGCTGCAGGAGCCCAGTATT- 3′ ，擴增產物片段長度為211 bp；大鼠β-actin上游引物為5′ -CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3′ ，下游引物為5′ -AGGGTACATGGTGGTGGCGCCAGAC-3′ ，擴增產物片段長度為587 bp。反應體系：Taq DNA聚合酶1 μL， dNTPs 2 μL，上樣染料2 μL，穩定劑、優化劑、反應緩沖液共25 μL，反轉錄反應產物2 μL，上、下游引物各2 μL，最后加水補至50 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃、10 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。半定量分析：取每個標本的擴增產物6 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker作為標準分子量標記，電泳后攝片，并進行光密度掃描，以β-actin校正作相對量分析，以目標基因與β-actin積分光密度的比值表示目標基因的表達水平。

2.6 肝組織中AQP8蛋白的表達

2.6.1 免疫組化法觀察肝組織中AQP8蛋白的表達 將4%多聚甲醛固定的肝組織常規脫水，石蠟包埋，切片（厚度為3 μm），磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗，3%H2O2液室溫孵育20 min，PBS清洗，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）微波爐內抗原修復30 min（92 ℃），室溫冷卻，PBS清洗，滴加10%正常山羊血清工作液封閉，37 ℃溫箱孵育30 min，吸棄多余血清，滴加兔抗鼠AQP8抗體（1 ∶ 100），4 ℃冰箱孵育過夜，PBS清洗；滴加二抗工作液，37 ℃溫箱孵育30 min，PBS清洗；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶素卵白素（S-A/HRP）工作液，37 ℃溫箱孵育30 min，PBS清洗；DAB室溫下顯色5 min，顯微鏡下監視，PBS充分沖洗，終止顯色。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖象分析系統，在放大100倍下每張切片取8個視野，陽性表達位于肝細胞胞漿，呈棕黃色，細胞核呈藍色，測定平均光密度作半定量分析。

2.6.2 Western blot法檢測肝組織中AQP8蛋白表達 取大鼠肝組織約100 mg，液氮研磨，然后轉移到含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟的900 μL RIPA中性裂解液中，混勻，超聲裂解，然后在4 ℃溫度下以離心半徑為10 cm、12 000 r/min離心15 min，收集上清（即總蛋白），進行蛋白含量的測定。蛋白煮沸變性后，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗（1 ∶ 600）4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，二抗（1 ∶ 3 000）室溫孵育1.5 h，PBST洗膜3次，暗室曝光，X膠片上顯影，采用Tanon1600全自動數碼凝膠圖像分析系統對膠片進行掃描，采用Tanon Gis軟件分析條帶灰度值，以AQP8蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示AQP8蛋白的表達水平。

2.7 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。數據以x±s表示，采用單因素方差分析，當方差不齊性時組間兩兩比較采用Dunnett T3檢驗，當方差齊性時采用LSD檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 血脂指標測定結果

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C 含量顯著升高（P<0.01），HDL-C含量顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），HDL-C含量顯著升高（P<0.01）。與澤瀉湯加味方低劑量組比較，陽性對照組和澤瀉湯加味方高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量顯著降低（P<0.01），HDL-C含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）；澤瀉湯加味方中劑量組大鼠血清中TC含量顯著降低（P<0.05）。與澤瀉湯加味方中劑量組比較，陽性對照組和澤瀉湯加味方高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），HDL-C含量顯著升高（P<0.05或P<0.01），結果見表1。

3.2 肝組織病理形態學觀察結果

空白對照組大鼠肝細胞為規則六邊形，排列整齊，圍繞中央靜脈呈放射狀分布；肝血竇結構正常，無脂肪滴和炎性浸潤。模型組大鼠肝細胞排列不整齊，且出現大量脂肪滴，細胞核位置被擠壓偏離；肝血竇充血水腫。陽性對照組大鼠肝細胞結構清晰，脂肪滴明顯減少；肝血竇充血水腫減輕，但存在細胞壞死及炎性浸潤。與模型組比較，澤瀉湯加味方高、中、低劑量組大鼠肝組織結構排列清晰，脂肪滴也不同程度減少，肝血竇形態趨于正常，其中尤以高劑量組效果最為顯著，結果見圖1。

3.3 肝組織中AQP8 mRNA表達水平測定結果

與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織中AQP8 mRNA表達水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中AQP8 mRNA表達均顯著降低（P<0.01）。與澤瀉湯加味方低、中劑量組比較，澤瀉湯加味方高劑量組大鼠肝組織中AQP8 mRNA表達均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。空白對照組、模型組、陽性對照組和澤瀉湯加味方低、中、高劑量組大鼠肝組織中 mRNA表達水平測定結果依次為0.272±0.011、0.596±0.014、0.511±0.018、0.483±0.035、0.461±0.122、0.383±0.020，電泳圖見圖2。

3.4 肝組織中AQP8蛋白表達水平測定結果

3.4.1 免疫組化測定結果 空白對照組大鼠僅在肝細胞的細胞膜上有少許AQP8蛋白表達，呈淺棕色。模型組大鼠除在細胞膜上有AQP8蛋白表達外，細胞核、細胞漿也表達較多，呈深棕色。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中AQP8蛋白的陽性表達數量、著色程度均降低，免疫組化圖見圖3。

半定量分析結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織中AQP8蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中AQP8蛋白表達水平均顯著降低，且澤瀉湯加味方高劑量組大鼠肝組織中AQP8蛋白表達水平低于澤瀉湯加味方低、中劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。空白對照組、模型組、陽性對照組和澤瀉加味方低、中、高劑量組大鼠肝組織中蛋白表達水平測定結果依次為0.018±0.004 3、0.054±0.009 3、0.045±0.007 5、0.042±0.007 8、0.037±0.005 7、0.029±0.006 8。

3.4.2 Western blot法測定結果 與空白對照組（0.341±0.069）比較，模型組（0.806±0.131）大鼠肝組織中AQP8蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，陽性對照組和澤瀉湯加味方低、中、高劑量組（0.685±0.100、0.571±0.073、0.512±0.061、0.431±0.069）大鼠肝組織中AQP8蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且澤瀉湯加味方高劑量組大鼠肝組織中AQP8蛋白表達水平低于澤瀉湯加味方低、中劑量組（P<0.05或P<0.01），電泳圖見圖4。

4 討論

中藥免煎顆粒是以傳統中藥飲片為原料，經提取濃縮制成的、供中醫臨床配方用的顆粒，具有統一規格、統一劑量和統一質量標準。其在味道和療效方面與中藥飲片煎煮后效果大體一致，且具有穩定性好、吸收快速、攜帶方便、應用方便等優點，目前使用較為流行，因此本研究選用了中藥免煎顆粒進行實驗。

AQPs是細胞膜上選擇性高效轉運水分子的特異孔道，其在維持細胞內外水液平衡具有重要的作用。AQPs介導水的轉運作用一旦失常，就會引起體內多種機能的紊亂。AQPs主要有13種亞型（AQP0～AQP12）[9]，肝組織中主要有AQP0、AQP1、AQP3、AQP8、AQP9、AQP11等6種亞型，其中以AQP8的表達量最高[10]。研究發現，AQP8又以兩種亞型存在于肝細胞中，一種與滲透性水轉運有關，另一種在線粒體上表達，參與了線粒體容量的穩態調節[11]。AQP8的表達異常，不僅影響著肝細胞通透性的強弱、水液代謝，而且關系著肝細胞線粒體的能量代謝，影響著肝細胞功能和肝對脂代謝作用的發揮。而HYP的病機關鍵是脾失健運、痰濕內阻，肝臟是脂質代謝的重要器官。因此，通過觀察肝組織中AQP8的表達變化，探討中藥及其復方防治HYP的作用機制具有重要意義，有望成為一個新的研究方向。

本研究結果顯示，模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C含量較空白對照組顯著升高，HDL-C含量較空白對照組顯著降低，這提示HYP造模成功；另外AQP8 mRNA及其蛋白的表達水平升高，提示大鼠血脂異常與肝組織中AQP8的表達失常可能存在相關性。而經澤瀉湯加味方治療后，HYP大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量顯著降低，HDL-C含量顯著升高，肝組織脂肪變性明顯改善，這提示澤瀉湯加味方良好地調節血脂作用；同時，大鼠肝組織中AQP8 mRNA及其蛋白的表達水平均顯著降低，推測該方可能通過下調大鼠肝組織中AQP8 mRNA及其蛋白的過度表達，降低了肝細胞過高的通透性，維持了細胞內外水液代謝的平衡，保護了肝細胞的正常功能，從而使肝正常地發揮脂質代謝的作用，這可能是澤瀉湯加味方防治HYP的機制之一，但其確切機制有待進一步驗證。

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（收稿日期：2017-05-22 修回日期：2017-12-11）

（編輯：林 靜）