大蒜素對慢性腎功能衰竭大鼠炎癥反應及腎臟組織纖維化的影響

許寧寧

（張家口市第一醫院，張家口　075000）

慢性腎功能衰竭（CRF）是多種慢性腎臟疾病導致腎功能減退，引發腎小球濾過率下降、毒素潴留、電解質代謝紊亂、酸堿失衡等，呈現全身多系統癥狀的一個臨床綜合征[1-2]，是各種腎臟疾病終末期的共同結局。既往研究發現，炎癥反應及腎臟組織纖維化是導致腎結構破壞、功能減退甚至喪失的主要病理原因，是各種慢性腎病發展為CRF的共同通路[3]，因此抑制腎纖維化是延緩腎功能衰竭的有效途徑，也是新藥研發的重要思路。大蒜素是一種具有降血脂、改善血流動力學等藥理學作用的二烯丙基三硫化物[4-5]，且葉靜等[6]和曾玉蘭等[7]研究發現大蒜素對肝組織纖維化和肺組織纖維化均具有一定的抑制作用，朱蘭香等[8]研究發現大蒜素對肝組織纖維化后炎癥研發具有抑制作用，但大蒜素對CRF后炎癥反應和腎臟組織纖維化的影響相關文獻報道尚不多見。本研究通過制備CRF大鼠模型，觀察大蒜素對CRF大鼠炎癥反應和腎臟組織纖維化的影響，探討大蒜素對CRF大鼠的保護作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性清潔級SD大鼠，7周齡，200～240 g，河北省實驗動物中心提供[SCXK（冀）：2013-1-003]。

1.2實驗藥物與試劑大蒜素注射液[黑龍江江世藥業有限公司，2 mL（30 mg）]；H&E 試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、尿酸（UA）、尿蛋白（Pro）試劑盒（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；C-Ⅳ、PC-Ⅲ、層黏連蛋白（LN）、纖維連接蛋白（FN）、C 反應蛋白（CRP）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（北京博奧森生物工程有限公司）；I型膠原（Col I）、纖溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）、基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）多克隆抗體SP試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；腺嘌呤（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3模型制備與分組參照文獻方法制備CRF大鼠模型[9]：25%腺嘌呤溶液250 mg/（kg·d）連續灌胃21 d制備CRF大鼠模型，正常對照組正常飲食與飲水。80只模型大鼠隨機分為模型組和大蒜素5、10、20 mg/（kg·d）組，每組20只，另設正常對照組（20只）。取大蒜素注射液并加適量生理鹽水配置濃度為10、5、2.5 mg/mL大蒜素溶液，各組大鼠分別給藥2 mL/kg，模型組和正常對照組分別給予等體積生理鹽水2 mL/kg，療程為28 d。

1.4實驗方法

1.4.1血清指標檢測腹腔注射10%水合氯醛實施麻醉，開腹并經腹主動脈取血（不抗凝），離心取血清，分別按照試劑盒使用說明進行處理，然后通過生化分析儀測定血清 BUN、SCr、UA、Pro含量；參照各指標酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒操作說明，通過酶標儀檢測血漿中CⅣ、PCⅢ、LN、HN水平；參照各指標ELISA檢測試劑盒操作說明，通過酶標儀檢測血清中CRP、IL-6、TNF-α含量水平。

1.4.2腎臟指數計算治療完成后分別稱鼠體質量，取雙側腎臟組織并稱左側腎質量，然后計算腎臟指數，腎臟指數=左側腎臟質量/體質量。

1.4.3腎臟組織病變觀察及病變評分取右側腎臟組織，置于多聚甲醛溶液（濃度為4%）中固定72 h，依次進行石蠟包埋、切片（3 μm）和常規脫蠟水化處理，按照HE染色試劑盒說明進行處理，封片后通過顯微鏡觀察腎臟組織病變并照相保存。腎臟組織病變評分：標準見表1。

表1　腎臟組織病變評分標準Tab.1　Criteria for classification of renal tissue lesions

1.4.4腎臟中Col I、PAI-1、MMP-1表達的測定取“1.4.3”制備的腎臟組織石蠟切片，經常規脫蠟水化處理后，采用SP法行免疫組織化學染色（IHC）觀察Col I、PAI-1、MMP-1表達。染色圖片均采用Motic Med 6.0病理圖像分析系統進行分析，分別選取5個不同的視野測定光密度值（OD），以OD表示Col I、PAI-1、MMP-1表達。

1.5統計學方法實驗數據運用SPSS 19.0進行數理統計分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，計量資料若呈正態分布，組間比較采用單因素方差分析；計量資料若呈偏態分布，組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1血清腎功能指標檢測結果與正常對照組比較，CRF模型組大鼠血清BUN、SCr、UA及尿液Pro含量均升高（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著降低CRF大鼠血清BUN、SCr、UA及尿液Pro含量（P＜0.05或 P＜0.01）。結果見表 2。

表2　各組大鼠血清腎功能及尿液Pro指標檢測結果（x±s）Tab.2　The results of serum renal function in rats of each group（±s）

表2　各組大鼠血清腎功能及尿液Pro指標檢測結果（x±s）Tab.2　The results of serum renal function in rats of each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別動物數BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）正常對照組　20　6.09±1.41　70.05±9.17模型組　20　24.07±3.82**　134.89±35.02**大蒜素5 mg/（kg·d）組2019.97±4.09125.90±36.82大蒜素10 mg/（kg·d）組2014.51±2.76##116.28±27.35#大蒜素20 mg/（kg·d）組2011.48±2.43##106.57±24.18#組別　動物數　UA（mmol/L）　Pro（mg/24 h）正常對照組　20　65.94±9.82　75.88±21.80模型組　20　114.76±16.53**　177.94±96.47**大蒜素5 mg/（kg·d）組2098.56±23.08169.81±98.85大蒜素10 mg/（kg·d）組2083.34±16.42##152.79±48.43#大蒜素20 mg/（kg·d）組2077.86±13.97##137.03±42.61##

2.2腎臟指數計算結果與正常對照組比較，CRF模型組大鼠體質量顯著降低且腎臟指數均顯著升高（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著提高CRF大鼠體質量并降低腎臟指數（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表 3。

表3　各組大鼠體質量、腎臟指數計算結果（±s）Tab.3　The body weight and kidney index in rats of each group（±s）

表3　各組大鼠體質量、腎臟指數計算結果（±s）Tab.3　The body weight and kidney index in rats of each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　動物數　體質量（g）　腎臟指數（×10-3）正常對照組　20　311.27±33.53　3.82±0.61模型組　20　208.67±31.59**　17.03±2.05**大蒜素5 mg/（kg·d）組20216.04±28.5215.85±1.91大蒜素10 mg/（kg·d）組20226.53±28.18#13.23±1.63##大蒜素20 mg/（kg·d）組20241.60±31.24#10.62±1.19##

2.3腎臟組織病變的觀察結果及病變評分的測定結果正常對照組大鼠腎小球、腎小管、間質區組織均未見異常，未見腎臟組織炎癥病變和纖維化病變；CRF模型組呈現腎小球增大變性、球囊粘連、囊腔和管腔擴大，腎小管內結晶、壞死處可見大量炎癥細胞和少量中性粒細胞浸潤,間質纖維組織大量增生，呈慢性進行性腎臟纖維化改變；大蒜素5、10、20 mg/（kg·d）組能夠不同程度改善CRF大鼠腎臟組織炎癥病變和纖維化病變，以20 mg/（kg·d）組最為顯著，結果見圖1。CRF模型組大鼠腎臟組織病變評分顯著升高（P＜0.01），大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著降低CRF大鼠病變評分（P＜0.01），結果見表4。

表4　各組大鼠腎臟組織病變評分（x±s）Tab.4　The scores of renal tissue lesions in rats of each group（±s）　分

表4　各組大鼠腎臟組織病變評分（x±s）Tab.4　The scores of renal tissue lesions in rats of each group（±s）　分

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別　動物數　病變評分正常對照組　20　0.69±0.25模型組　20　9.43±0.58**大蒜素 5 mg/kg·d 組　20　8.14±0.76大蒜素 10 mg/kg·d 組　20　6.82±0.66##大蒜素 20 mg/kg·d 組　20　6.22±0.59##

2.4血清中C-IV、PC-Ⅲ、LN、FN水平測定結果與正常對照組比較，CRF模型組大鼠血清中C-IV、PC-III、LN含量水平顯著升高且FN水平顯著降低（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著降低CRF大鼠血清C-IV、PC-Ⅲ、LN水平并提高FN 水平（P＜0.05或 P＜0.01）。結果見表 5。

表 5　各組大鼠血清中 C-IV、PC-III、LN、FN 水平（±s）Tab.5　The levels of C-IV,PC-III,LN and FN in serum of rats of each group（±s）

表 5　各組大鼠血清中 C-IV、PC-III、LN、FN 水平（±s）Tab.5　The levels of C-IV,PC-III,LN and FN in serum of rats of each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別動物數C-I V（n g/m L）P C-I I I（n g/m L）正常對照組　2 0　1 2.8 7±2.6 1　1 9.8 9±4.5 6模型組　2 0　6 7.5 3±8.3 9**　5 4.2 0±7.0 8**大蒜素5 m g/（k g·d）組2 0 5 9.1 8±9.1 7 4 7.5 4±7.9 4大蒜素1 0 m g/（k g·d）組2 0 4 0.2 6±7.1 2#3 2.0 3±5.8 9#大蒜素2 0 m g/（k g·d）組2 0 2 3.7 9±4.2 5##2 4.3 1±5.8 4##組別　動物數　L N（n g/m L）　F N（m g/L）正常對照組　2 0　2 5.0 8±1 1.0 2　1 4 7.6 1±3 3.8 5模型組　2 0　1 1 7.8 3±3 5.7 6**　6 6.7 2±1 3.0 9**大蒜素5 m g/（k g·d）組2 0 1 0 7.5 8±4 0.8 1 7 9.5 6±1 8.6 2大蒜素1 0 m g/（k g·d）組2 0 9 9.0 5±3 8.1 7 9 8.5 8±2 1.4 3#大蒜素2 0 m g/（k g·d）組2 0 8 3.4 2±2 8.8 3#1 2 5.9 6±2 5.1 2##

2.5血清中炎癥因子含量測定結果CRF模型組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量均顯著升高（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著降低CRF大鼠血清 CRP、TNF-α 含量（P＜0.05或 P＜0.01），其中20 mg/（kg·d）組能夠降低IL-6含量（P＜0.05）。結果見表6。

表6　各組大鼠血清中炎癥因子含量（±s）Tab.6　The levels of inflammatory factors in serum of rats of each group（±s）

表6　各組大鼠血清中炎癥因子含量（±s）Tab.6　The levels of inflammatory factors in serum of rats of each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　動物數 CRP（mg/L） IL-6（ng/L）　TNF-α（ng/L）正常對照組　20　5.30±1.07　40.83±2.19　71.90±3.52模型組　20　11.64±1.95**94.70±5.05**255.87±31.93**大蒜素5 mg/（kg·d）組2010.73±2.3090.06±6.28225.86±30.07大蒜素10 mg/（kg·d）組208.79±1.84#84.84±5.81184.37±24.15##大蒜素20 mg/（kg·d）組207.51±1.69##78.26±5.59#126.82±12.96##

2.6腎臟組織中Col I、PAI-1、MMP-1表達測定結果與正常對照組比較，CRF模型組大鼠腎臟組織Col I、PAI-1表達顯著上調而MMP-1表達顯著下調（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著下調Col I、PAI-1 表達并上調 MMP-1（P＜0.05 或 P＜0.01）。結果見表7和圖2-4。

表7　各組大鼠腎臟組織中Col I、PAI-1、MMP-1表達OD 值（±s）Tab.7　The OD of the expression Col I,PAI-1 and MMP-1 in the kidney tissues in rats of each group（±s）

表7　各組大鼠腎臟組織中Col I、PAI-1、MMP-1表達OD 值（±s）Tab.7　The OD of the expression Col I,PAI-1 and MMP-1 in the kidney tissues in rats of each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　動物數　Col I　PAI-1　MMP-1正常對照組　20　0.04±0.02　0.06±0.02　0.29±0.06模型組　20　0.27±0.05**0.31±0.08**0.04±0.02**大蒜素5 mg/（kg·d）組200.25±0.060.24±0.070.06±0.02大蒜素10 mg/（kg·d）組200.17±0.03#0.20±0.05#0.10±0.03#大蒜素20 mg/（kg·d）組200.09±0.03##0.16±0.04#0.22±0.05##

圖1　各組大鼠腎臟組織病變（HE，×200）Fig.1　The renal tissue lesions in rats of each group(HE,×200)

圖2　各組大鼠腎臟組織Col I表達（IHC，×400）Fig.2　The expression of Col I in renal tissue in rats of each group（IHC,×400）

圖3　各組大鼠腎臟組織PAI-1表達（IHC，×400）Fig.3　The expression of PAI-1 in renal tissue in rats of each group（IHC,×400）

圖4　各組大鼠腎臟組織MMP-1表達（IHC，×400）Fig.4　The expression of MMP-1 in renal tissue in rats of each group（IHC,×400）

3　討論

本實驗通過腺嘌呤溶液250mg/（kg·d）灌胃21d的方法建立CRF動物模型[10]，研究發現經大蒜素治療28 d能夠有效降低CRF大鼠血清 BUN、SCr、UA、24 h尿蛋白含量，抑制CRF大鼠腎臟組織病變，提高體質量并降低腎臟指數，提示大蒜素具有改善CRF大鼠腎功能、對其腎臟組織具有一定的保護作用。

腎臟組織纖維化是各種腎臟慢性疾病逐漸發展為CRF的共同病理通路，因此阻滯其纖維化是延緩CRF的必要途徑。Col I是腎組織間質中存在的主要膠原成分，Col I大量積聚是腎組織纖維化的重要原因[11]。正常生理狀態下，Col I生成與降解處于動態平衡，基質金屬蛋白酶系（MMPs）和絲氨酸蛋白酶系（PAIs）是機體Col I表達的主要調控酶。MMPs系統中MMP-1和PAIs系統中的PAI-1對Col I及腎臟組織細胞外基質（ECM）的合成與降解起主要調控作用[12-13]。其中PAI-1具有抑制纖溶酶原激活物活化而抑制MMP-1活性的作用，因此在MMP-1、PAI-1構成的 Col I降解調控系統中，MMP-1是降解Col I的主要調控酶，而PAI-1主要是通過調節MMP-1活性而間接調控Col I的降解[11]。C-IV、LN、FN是構成ECM的主要成分，Border WA等[14]研究發現血清C-IV、LN含量升高及FN降低是慢性腎衰病變的重要臨床指征。PC-Ⅲ是一種間質膠原，廣泛存在于腎組織中，其聚集升高是促進腎臟組織纖維化和腎小球硬化的重要原因。本研究發現，經大蒜素治療28 d能夠有效降低CRF大鼠血清C-IV、LN、PC-Ⅲ含量并升高FN含量；通過IHC觀察發現，經大蒜素治療28 d能夠有效下調CRF大鼠腎臟組織Col I蛋白表達并下調PAI-1表達、上調MMP-1表達，提示大蒜素調節MMPs、PAIs調控系統并調節血清C-IV、LN、PC-Ⅲ、FN含量而具有抑制CRF大鼠腎臟組織纖維化的作用。

腎臟組織纖維化病理機制非常復雜，楊婧等[15]研究發現炎癥細胞浸潤在腎臟組織纖維化病變過程中發揮著重要作用。血清炎癥細胞因子（CRP、IL-6、TNF-α）含量水平是臨床監測機體炎癥反應的常用指標[16]。本研究發現，經大蒜素治療28 d能夠有效降低 CRF大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α含量水平，進而起到抑制炎癥反應的作用。

綜上所述，大蒜素可能通過抑制炎癥反應和腎臟組織纖維化而對CRF大鼠起到一定的保護作用，機制可能與大蒜素調節MMPs、PAIs調控系統并調節血清C-IV、LN、PC-III、FN含量，以及抑制炎癥反應有關。