基于益腎填精法的茸菖膠囊對無鎂誘導癲癇模型自噬相關蛋白影響的研究*

戎　萍，彭　博，張喜蓮，趙　偉，張雪榮，王　偉，張雪竹，馬　融

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院兒科，天津　300193；2.天津大學，天津　300072；3.新疆伊犁州中醫醫院兒科，伊犁　835000；4.湖北省中醫院兒科，武漢　430061）

癲癇是小兒神經系統的常見病之一，以反復癲癇發作為共同特征的慢性腦部疾病狀態。癲癇發作與神經元損傷密切相關。一方面，神經細胞壞死、缺失、結構異常等使腦細胞維持電位穩定的能力下降，一旦有誘發因素則易引發癲癇。另一方面，長期或反復的癲癇活動，可對未成熟大腦的發育、神經元功能、可塑性相關基因表達造成長期不良影響[1-2]。細胞自噬被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，其在癲癇等神經系統疾病中的作用正成為研究的熱點。細胞自噬的作用具有雙重性，低水平的自噬對細胞具有保護作用，過度的自噬可致神經元損害。Beclin-1是自噬的正調節蛋白，是介導其他自噬蛋白定位于前自噬小體的關鍵因子。研究表明反復驚厥新生大鼠皮質Beclin-1水平明顯上調，自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）通過抑制Beclin-1表達，參與自噬途徑的調控[3]。B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）能夠減弱Beclin-1與Vps34的相互作用，使其他自噬相關蛋白難以結合到自噬體膜上，從而抑制自噬的發生[4]。課題組前期研究已證實，以“益腎填精法”為主的茸菖膠囊抗癲癇及改善認知損害療效顯著[5]，在保護受損神經細胞方面具有明顯優勢[6-7]，其機制是否與調控海馬神經元自噬過程相關尚未研究。本研究通過構建無鎂誘導的癲癇模型，觀察茸菖膠囊干預后 6、12、24、72 h 對海馬 Beclin-1、Bcl-2 蛋白表達的影響，探討其抗癲癇和神經保護作用的自噬調控機制。

1　實驗材料

1.1實驗動物健康成年大耳白家兔30只，雌雄均可，體質量2～2.5 kg，購自北京金牧陽實驗動物養殖有限責任公司[合格證號：SCXK（京）2015-0005]。24 h內新生SD大鼠50只，購自北京芳元緣養殖場。

1.2實驗藥品與試劑茸菖膠囊（由天津中醫藥大學第一附屬醫院提供，批件號：津藥制字Z20070735）；3-MA（Sigma公司）。5x SDS凝膠加樣緩沖液、顯影液、定影液、胰酶細胞消化液等購自碧云天生物技術公司；30%丙烯酰胺Acr/Bic、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷等購自 Ameresco 公司；吐溫、MgCl2·6H2O、NaCl、CaCl2等購自 Sigma公司；PageRuler Prestained Protein Ladder（Thermo scientific）；ECL發光液（普利萊基因技術有限責任公司）、甲醇（國藥集團）、麗春紅（碧云天生物技術研究所）。

2　實驗方法

2.1腦脊液提取家兔予茸菖膠囊灌胃3 d，每日劑量按生藥為3.64 g/kg，于末次給藥1 h后取腦脊液。耳緣動脈注入空氣處死后，于小腦延髓池穿刺針穿刺成功后，用一次性1 mL注射器吸取600～800 μL清亮腦脊液，放入滅菌后的EP管中，于冰箱-70℃凍存。

2.2原代海馬神經元的培養取新生SD大鼠海馬，乙醇消毒后斷頭取腦，浸置于冰磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液中，鈍性分離出海馬，剝離腦膜后快速剪成碎塊，用胰蛋白酶消化20 min，加入冰PBS溶液終止消化，加入種植培養液，以每毫升2×105～3×105個的濃度將神經元接種于L-多聚賴氨酸包被好的培養皿中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養4 h，之后更換維持培養液。

2.3海馬神經元癲癇模型建立參照Sombati等[8]人的癲癇模型制備方法將體外培養至第9天時用無鎂HBSS替代含鎂正常培養基，溫箱中孵育3 h，建立癲癇細胞模型。繼而將HBSS溶液再次換為含鎂Neurobasal培養基繼續培養。該實驗模型建立后需要電生理實驗鑒定模型建立是否成功。

2.4實驗分組當海馬神經元培養至第9天時，將其分為下述6組并進行相應處理。正常組、模型組、3-MA組、5%茸菖膠囊組、10%茸菖膠囊組、20%茸菖膠囊組，分別將原維持液更換為含鎂HBSS、無鎂細胞外液、無鎂細胞外液中加入3-MA（5mmol/L）、無鎂外液中加入5%茸菖膠囊、10%茸菖膠囊、20%茸菖膠囊腦脊液，培養3 h后更換為Neurobasal培養液繼續培養6、12、24、72 h用于實驗。

2.5蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測目標蛋白表達提取細胞總蛋白并測定蛋白濃度后，將樣品蛋白進行凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育（內參抗體稀釋度為1∶1 000）、二抗孵育（二抗稀釋比例為 1∶10 000）等步驟，ECL 法顯色（暗室操作），凝膠圖像分析系統測定光密度值，用ImageJ 1.43軟件分析灰度值。

2.6統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件，計量數據以均數±標準差（±s）表示，不同時間點比較采用重復測量方差分析，多組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3　結果

3.1各組大鼠海馬Beclin-1蛋白表達比較經重復測量方差分析，各組間海馬Beclin-1蛋白表達水平總體均數差異有統計學意義（P＜0.05），各時間點Beclin-1蛋白表達水平總體均數差異有統計學意義（P＜0.01），時間和分組不具有交互作用（P＞0.05）。同一組內，各時點Beclin-1蛋白比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。與同一時點正常組比較，模型組Beclin-1蛋白表達無顯著變化（P＞0.05）；與同一時點模型組比較，6 h 20%茸菖膠囊組及72 h 5%茸菖膠囊組顯著升高（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1　不同時點各組Beclin-1蛋白電泳圖Fig.1　Electrophoretogram of Beclin-1 protein in each group at different time

表1　各組大鼠海馬Beclin-1蛋白表達比較（±s）Tab.1　Comparison of Beclin-1 protein expression in hippocampal neurons of rats in each group（±s）

表1　各組大鼠海馬Beclin-1蛋白表達比較（±s）Tab.1　Comparison of Beclin-1 protein expression in hippocampal neurons of rats in each group（±s）

注：與同時點模型組比較，*P＜0.05。

組別正常組模型組3-MA組5%茸菖組10%茸菖組20%茸菖組n　3　3　3　3　3　3處理后6 h　處理后12 h　處理24 h　處理后72 h 1.00±0.00　1.00±0.00　1.00±0.00　1.00±0.00 0.95±0.09　1.25±0.15　1.28±0.07　0.80±0.25 0.87±0.29　1.07±0.50　1.03±0.37　0.69±0.40 1.11±0.22　1.44±0.25　1.48±0.23　1.28±0.14*1.23±0.21　1.40±0.11　1.71±0.54　1.18±0.13 1.28±0.12*　1.61±0.60　1.71±0.74　1.10±0.30

3.2各組大鼠海馬Bcl-2蛋白表達比較經重復測量方差分析，各組間海馬Bcl-2蛋白表達水平總體均數差異有統計學意義（P＜0.01），各時間點Bcl-2蛋白表達水平總體均數差異有統計學意義（P<0.01），時間和分組不具有交互作用（P＞0.05）。同一組內，各時點Bcl-2蛋白比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。與同一時點正常組比較，6 h模型組Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。與同一時點模型組比較，12 h 20%茸菖膠囊組，24 h 20%茸菖膠囊組，72 h 5%茸菖膠囊組、10%茸菖膠囊組、20%茸菖膠囊組Bcl-2蛋白表達均顯著增強（P＜0.05或P＜0.01）。72 h茸菖膠囊高、中、低三個濃度比較，20%茸菖膠囊組Bcl-2蛋白表達較5%茸菖膠囊組和10%茸菖膠囊組顯著增強（P＜0.05），5%茸菖膠囊組與10%茸菖膠囊組比較無統計學差異（P＞0.05）。見圖 2、表 2。

圖2　不同時點各組Bcl-2蛋白電泳圖Fig.2　Electrophoretogram of Bcl-2 protein in each group at different time

表2　各組大鼠海馬Bcl-2蛋白表達比較（x±s）Tab.2　Comparison of Bcl-2 protein expression in hippocampal neurons of rats in each group（x±s）

3.3各組大鼠海馬LC3B蛋白表達比較與同一時點正常組比較，12 h模型組海馬神經元LC3B蛋白表達顯著增強（P＜0.05）。與同一時點模型組比較，12 h 20%茸菖膠囊組LC3B蛋白表達顯著下降（P＜0.05）。見表 3。

表3　各組大鼠海馬LC3B蛋白表達比較（x±s）Tab.3　Comparison of LC3B protein expression in hippocampal neurons of rats in each group（x±s）

4　討論

近年來自噬在癲癇發生、發展過程中的重要作用逐漸受到認識。癲癇發作會引起氧化應激、離子通道異常、谷氨酸神經興奮毒性、三磷腺苷耗竭、腫瘤壞死因子-α升高等，在這些情況下都會導致神經元自噬的發生。自噬被過度激活，可致神經元死亡，加重海馬損傷及癲癇發作，并造成學習記憶及情感障礙[9-10]。在自噬啟動階段，Beclin-1是自噬的調控基因，發揮自噬正調節作用。而Bcl-2則能夠抑制自噬的發生[11]。Beclin-1與Bcl-2作用而調控自噬與凋亡之間的平衡，自癲癇發作12～8h Beclin-1蛋白水平開始升高，而Bcl-2蛋白水平自癲癇發作24～48 h逐漸下降[12]。研究表明，自噬抑制劑能夠通過調節自噬相關蛋白Beclin-1、Bcl-2的表達，調控癲癇或驚厥大鼠海馬自噬活性，從而減少海馬神經元的損傷，起到抗癲癇及神經保護作用[3，13-14]。

傳統中醫認為，癲癇的病機關鍵為風痰閉阻，多采用熄風豁痰開竅法治療。馬融教授認為，癲癇發作對于發育期的兒童而言，造成的神經損害更明顯，且長期反復的癲癇發作常導致認知障礙的發生，因此治療小兒癲癇應抗癇與益智并舉。根據小兒“腎常虛”的生理特點及腎與腦的密切關系，提出小兒癲癇伴認知障礙的病機關鍵在于“腎精虧虛、風痰閉阻”。據此研制了茸菖膠囊（原名抗癇增智顆粒），重在抗癇與益智并舉。課題組前期研究已證實，以“益腎填精法”為主的茸菖膠囊抗癲癇及改善認知損害療效顯著，在保護受損神經細胞方面具有明顯優勢，但這是否與茸菖膠囊調控受損神經元自噬活性有關尚未研究。本研究結果顯示：1）茸菖膠囊可影響Beclin-1蛋白表達。高濃度茸菖膠囊腦脊液可在短時間內促進Beclin-1蛋白表達明顯，低濃度茸菖膠囊腦脊液在維持Beclin-1蛋白表達作用較優。2）茸菖膠囊可促進Bcl-2蛋白表達抑制細胞自噬，其促進作用與給藥濃度相關。綜上所述，基于益腎填精法的茸菖膠囊可能通過影響Beclin-1表達干預自噬過程，促進Bcl-2蛋白表達抑制細胞自噬，發揮抗癲癇及保護海馬神經元的作用。