三七總皂苷對杠柳毒苷藥代動力學的影響*

劉華明，李　麗，馬文娟，賈　琪，歐陽慧子，何　俊

（1.天津市現代中藥重點實驗室，天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津　300193）

香加皮（Cortex Periplocae），又名北五加皮、杠柳皮，是蘿藦科植物杠柳（Periploca Sepium Bge）的干燥根皮[1]，最早記載于《神農本草經》，《中國藥典》自1977年起均有收載[2]。杠柳毒苷為香加皮的主要有效、有毒成分，經口服代謝后可轉化成杠柳次苷和杠柳苷元[3]。研究表明，杠柳毒苷具有強心[4]、抑制腫瘤細胞增殖[5]等藥理作用，同時也具有一定的毒副作用，過量使用會出現室性早博、心室顫動、心房顫動、房室傳導阻滯等不良反應[6]，臨床主要用于風濕、慢性充血性心力衰竭和心源性水腫的治療[7]。目前，國內外已有研究采用高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）法[8]和液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）[9]法測定大鼠血漿中杠柳毒苷的含量，但HPLC-UV法的專屬性差、靈敏度低，易受血漿內源性雜質的干擾；而在本課題組已報道的LC-MS/MS法[9]中，本研究采用單次灌胃給藥的方式，結果顯示杠柳毒苷的代謝物杠柳次苷和杠柳苷元存在一定的藥動學規律，但原型藥物杠柳毒苷的藥動學行為仍舊不清晰。因此，為了更加深入了解杠柳毒苷在大鼠體內的代謝過程，本研究對原有的LC-MS/MS法進行了優化，使其能應用于配伍給藥方式的藥動學研究，希望能夠闡明不同配伍比例的三七總皂苷對杠柳毒苷在大鼠體內的藥動學過程的影響，為臨床上香加皮配伍三七提供藥動學理論依據。

1　儀器與材料

1.1儀器Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國，Agilent公司）；Agilent 6430三重四級桿串聯質譜儀（美國，Agilent公司）；Agilent MassHunter分析軟件（美國，Agilent公司）；AX 205型十萬分之一天平（瑞士，Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水制備儀（Millipore公司）；3K15型高速離心機（美國，Sigma公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2試藥杠柳毒苷（成都德思特生物技術有限公司，批號：DST170907-041，純度≥98%）；補骨脂素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110739-201416，純度≥98%）；三七總皂苷（成都德思特生物技術有限公司，其中 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和 Rg1 總量大于65%）；色譜純甲醇、色譜純乙腈（美國Thermo Fisher Scientific Inc）；甲酸（美國ROE scientific Inc.）；分析純乙酸乙酯（天津康科德科技有限公司）；超純水自制。

1.3實驗動物及給藥方式健康雄性SD大鼠（220～230）g，SPF級，購自北京華阜康實驗動物技術有限公司，實驗動物質量合格證號：No.11401300070656，許可證號：SCXK(京)2014-0004。18只大鼠被分為杠柳毒苷單獨給藥組（A組）、杠柳毒苷和低劑量三七總皂苷配伍組（B組）、杠柳毒苷和高劑量三七總皂苷配伍組（C組）。杠柳毒苷給藥劑量為10mg/（kg·d），三七總皂苷給藥量分別為0.74g/（kg·d）和2.22 g/（kg·d）（分別相當于香加皮和三七的比例為 1∶1 和 1∶3，前期實驗獲得的換算因子為 8.11）。采用灌胃給藥的方式，連續給藥7 d。

2　方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Waters CORTECSTM C18柱（2.1 mm×50 mm,2.7 μm）；流動相：乙腈（B）-0.1%甲酸水（A）；梯度洗脫，洗脫程序為：0～7 min，19%～50%B；7～9 min，50% ～50%B；洗脫時間 9 min；流速為 0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

2.2質譜條件離子源為電噴霧離子源（ESI），檢測模式為多反應離子監測（MRM），正離子監測；Delta EMV（＋）：500 V；Gas Temp：300 ℃；Gas Flow：11 L/min；Nebulizer：15 psi。杠柳毒苷定量離子對為719.4→719.4，碎裂電壓135 V，碰撞能量3 V；內標補骨脂素定量分析離子對為187.0→131.1，碎裂電壓115 V，碰撞能量25 V。

2.3溶液的配制

2.3.1杠柳毒苷標準溶液精密稱取杠柳毒苷10.03mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，配制為1.003 mg/mL的儲備液，4℃冰箱儲存備用。精密量取一定體積的杠柳毒苷儲備液，用甲醇依次稀釋成質量濃度為 5、10、25、50、125、500、2 000、2 500 ng/mL的系列標準溶液備用。

2.3.2內標溶液量取補骨脂素對照品10.01 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋為1.001 mg/mL的儲備液，4℃冰箱儲存備用。量取一定的補骨脂素儲備液用甲醇稀釋成1 μg/mL的內標溶液備用。

2.4血漿樣品預處理精密量取血漿樣品100 μL，加入內標溶液 20 μL（補骨脂素，1 μg/mL），20 μL 甲醇，渦旋混勻，再加入2mL乙酸乙酯渦流振蕩5min，14 000 r/min離心10 min后，取上清液2 mL氮氣吹干，用100 μL 50%甲醇復溶，渦旋振蕩5 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液5 μL進行LCMS/MS分析。

2.5方法學考察

2.5.1專屬性精密量取空白血漿100 μL，加甲醇40 μL，其他按2.4項下處理并取上清進樣分析，得色譜圖1（A）；將一定濃度的杠柳毒苷對照品溶液及內標溶液加入空白血漿中，依同法處理，得色譜圖1（B）；取大鼠灌胃后的血漿樣品，依同法處理，得色譜圖1（C）。杠柳毒苷和內標補骨脂素的保留時間分別是3.35 min和4.31 min。血漿樣品中內源性成分目標性成分互不干擾，結果如圖1。

2.5.2標準曲線及線性范圍精密量取大鼠空白血漿100 μL，加入一系列濃度的杠柳毒苷對照品溶液20 μL，再加入20 μL的內標溶液后，配制成血漿中杠柳毒苷濃度分別為 1、2、5、10、25、100、400、500 ng/mL的血漿樣品，按照2.4項下的血漿樣品處理方法進行處理，取上清液進行分析并記錄色譜圖，以杠柳毒苷與內標的峰面積比值（Y?）為縱坐標，杠柳毒苷的濃度（X）為橫坐標，用加權最小二乘法進行線性回歸計算，權重系數為1/X，獲得杠柳毒苷的線性回歸方程及相關系數（Y?=0.129 565X-0.000 347 821 1，r=0.994 9），以 S/N≥10 為標準，杠柳毒苷的定量限是1.0 ng/mL，RSD≤13.89%，RE為10.43%。

圖1　大鼠血漿中杠柳毒苷（1）和內標（2）的MRM圖Fig.1　Representative MRM chromatograms of Periplocin(1)and IS(2)in rats plasma

2.5.3精密度與準確度精密量取空白血漿100μL，分別加入3種不同濃度的杠柳毒苷對照品溶液，使他們的終濃度為2、25、400 ng/mL，每個濃度溶液各6份，按照2.4項下進行處理，連續測定3 d，并與標準曲線同時進行，記錄峰面積，計算日內、日間精密度，得杠柳毒苷日內、日間精密度RSD值分別小于13.94%和8.94%，準確度在91.87%～101.36%之間。

2.5.4回收率及基質效應量取大鼠空白血漿100 μL，按2.4項下的處理方法，制備成濃度為2、25、400 ng/mL的低、中、高3種濃度血漿樣品各6 份，進樣量為 5 μL，記錄下峰面積（A1）；另取空白血漿 100 μL，加入 40 μL 甲醇，按照 2.4 項下的方法處理后，用相應低、中、高3個濃度的杠柳毒苷對照品復溶，進樣量為 5 μL，記錄下峰面積（A2），則提取回收率為R=A1/A2×100%；同樣條件下進相應的低、中、高3個濃度杠柳毒苷對照品溶液，記錄下相應峰面積（A0），則基質效應為M=A2/A0。3個濃度QC樣品的回收率分別為（86.20±0.06）%、（94.15±0.03）%和（90.23±0.04）%；內標補骨脂素的提取回收率為（90.65±0.04）%。3個濃度QC樣品的基質效應分別為（90.54±0.06）%、（84.60±0.04）%和（93.86±0.03）%；內標補骨脂素的基質效應為（91.49±0.09）%。

2.5.5穩定性考察取大鼠空血漿100 μL，配成低、中、高 3種濃度（2、25、400 ng/mL）的 QC 樣品各3份，按照2.4項下的方法處理，分別考察其在室溫下6h再處理，血漿樣品處理后放置自動進樣器12h，反復凍融3次，血漿樣品-70℃冰箱中冷凍14 d穩定性。杠柳毒苷準確度在93.35%～113.13%之間，RSD值在1.79%～14.66%之間。結果表明杠柳毒苷在上述條件下穩定性良好。

2.6藥動學研究18只健康雄性SD大鼠，在最后1次給藥前禁食12 h，期間可自由飲水，分別在最后1 次給藥前以及給藥后 0.033、0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 經大鼠目內眥取血，置于肝素離心管中，6 000 r/min離心10 min，取上清后置于-70℃冰箱儲存，直至進樣分析。3種給藥方式下杠柳毒苷的平均血藥濃度-時間曲線見圖2，采用DAS 1.0軟件計算3組大鼠口服杠柳毒苷后的藥動學參數，見表1。實驗數據經SPSS 19.0統計軟件處理，采用單因素方差分析比較各組間的藥動學參數差異。

圖2　大鼠灌胃給藥后杠柳毒苷的平均血藥濃度-時間曲線±s,n=6)Fig.2　Mean plasma concentration-time curve of Periplocin in rats after oral administration±s,n=6)

3　討論

本實驗對原有的LC-MS/MS法進行了優化，該方法專屬性好，靈敏度高，線性范圍廣（1～500 ng/mL），線性關系良好（r=0.994 9），和原方法相比運行時間短。經方法學驗證，本方法符合生物樣品的測定要求，滿足大鼠血漿中杠柳毒苷的含量測定。

Jia等[10]采用靜脈注射和腹腔注射的給藥方式，利用LC-MS/MS法測定大鼠血漿和組織中杠柳毒苷的含量，結果顯示杠柳毒苷的藥代動力學行為存在一定規律，各組織樣品中杠柳毒苷的含量均能被檢測到，但在大多數組織中，90%的杠柳毒苷在60 min后被降解；而本課題組[9]采用單次灌胃給藥方式，利用LC-MS/MS法測定大鼠血漿中杠柳毒苷及其代謝物杠柳次苷和杠柳苷元的含量，結果發現，杠柳毒苷僅在大鼠給藥后很短的時間內可被檢測到，無法擬合完整的藥時曲線。而本研究中，大鼠被連續灌胃給藥7 d后，檢測大鼠血漿中杠柳毒苷的含量，結果表明，給藥后各時間點的血漿樣品中的杠柳毒苷均能被檢測到；且與三七總皂苷配伍給藥后，杠柳毒苷的藥代動力學行為有明顯改變，主要表現為兩個配伍組與杠柳毒苷單獨給藥組的Cmax、AUC0-t和 AUC0-∞存在顯著性差異，杠柳毒苷和低劑量三七總皂苷配伍組與杠柳毒苷單獨給藥組的Tmax值也存在顯著性差異；隨著配伍的三七比例增大，杠柳毒苷的T1/2、AUC0-t和AUC0-∞值呈遞減趨勢。上述結果說明連續灌胃給藥可以使杠柳毒苷在大鼠體內的代謝速度發生改變，三七總皂苷對杠柳毒苷的藥動學過程存在一定影響。

表1　不同組大鼠灌胃給藥后杠柳毒苷的主要藥動學參數±s)Tab.1　Pharmacokinetic parameters of Periplocin of rats in different groups±s)

表1　不同組大鼠灌胃給藥后杠柳毒苷的主要藥動學參數±s)Tab.1　Pharmacokinetic parameters of Periplocin of rats in different groups±s)

注：與 A 組比較，*P＜0.05。

組別A組B組C組動物數6　6　6 Cmax(ng/mL)　Tmax(h)　T1/2(h)　Ke(1/h)　AUC0-t(ng·h/mL)　AUC0-∞(ng·h/mL)260.79±141.53　0.063±0.027　5.26±3.28　0.19±0.13　988.21±469.16　1 593.61±815.18 23.98±　9.72*　0.183±0.092*　4.08±1.98　0.21±0.123　122.75± 74.71*　213.26± 96.05*29.21± 19.47*　0.283±0.209　1.91±1.13　0.461 7±0.265 2　119.45± 68.74*　168.38± 94.26*