金釵石斛及其提取物的紅外光譜整體解析*

賀雨馨，曾宇馨，祝天添，朱南南，孫志蓉

（北京中醫藥大學中藥學院，北京　102488）

蘭科植物金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）為2015年版中國藥典中記載的石斛藥材來源之一，具有養胃生津、滋陰清熱等作用[1]。現代藥理研究其具有明目、抗疲勞、抗衰老等作用[2]。金釵石斛的化學成分主要有多糖、生物堿、酚類化合物等[2]，具有良好的保健功能和營養價值，在市場上的需求也在不斷增加。石斛屬為蘭科中最大的屬之一，且石斛屬中的藥用石斛種類多達50多種[3]，使得在石斛市場中存在著以假充真、以次充好的情況。為保證金釵石斛藥材的質量及臨床用藥的安全可靠，建立一種快速簡便有效的鑒別方法極為重要。

傅里葉紅外光譜法鑒別中藥材是近年發展起來的一種中藥材鑒定方法。紅外光譜技術應用于中藥材的鑒別和定性分析具有快速、簡便、準確、用樣量少、不破壞樣品、不消耗化學試劑、不污染環境等優點，且能夠反映藥材的整體特征。有多個研究[4-7]采用紅外光譜法對多種中藥材進行鑒定和整體分析。隨著傅里葉紅外光譜法在中藥材中的不斷應用，有學者將其應用到金釵石斛的研究中，鄧月娥等[8]和李瑩等[9]對不同產地、不同種的金釵石斛進行紅外光譜研究，但其只針對原藥材進行了研究，并未對其不同提取物進行研究。石斛作為藥食兩用的藥材，以其為原料配方的中藥制劑和保健品年需求總量為8 000～10 000 t，且每年以10%～15%的速度遞增[10]，這不僅需要有一個快捷鑒別金釵石斛藥材的方法，同時還需要有針對其不同提取物進行快速鑒別的方法。本研究采用傅里葉紅外光譜和二階導數譜對金釵石斛不同提取溶劑中化學成分的整體變化規律進行分析，為金釵石斛的提取方法，有效部位的確定，金釵石斛的整體評價和快速鑒別提供一定的依據。

1　材料與方法

1.1樣品來源樣品由北京中醫藥大學孫志蓉教授鑒定為蘭科植物金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）的干燥莖（由貴州赤水信天藥業公司提供）。

1.2儀器與試劑儀器：Spectrum GX FTIR紅外光譜儀（美國Perkin Elmer），DTGS檢測器，光譜測量范圍 400～4 000 cm-1，光譜分辨率為 4 cm-1，掃描次數為16次，OPD速度為0.2 cm-1/s，掃描時實時扣除水和二氯化碳（CO2）的干擾；變溫附件為50-886型Portable Controller可編程控制單元（Love Control公司），控溫范圍是50～120℃，程序控制，原位等間隔采樣，每隔10℃進行1次紅外光譜掃描，升溫速率為2℃/min；METTLER-AE240型1/100 000電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；XMTD-6000儀表恒溫水浴鍋（上海樹立儀器儀表有限公司）；RJ-LDL-50G低速大容量多管離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；ZN-02小型粉碎機（北京興時利和科技發展有限公司）。

試劑：溴化鉀（純度為99.9%）、濃硫酸、苯酚、乙醇均為分析純（北京化工廠）；淀粉和油類標準品由中國藥品生物制品檢定所提供。草酸鈣標準品由清華大學化學實驗室提供，購自西格瑪奧德里奇貿易有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1藥材粉末的制備金釵石斛藥材進行干燥粉碎，過3號篩，將藥材粉末用溴化鉀粉末混合充分研磨（藥材與溴化鉀用量之比約為2∶100）壓片。對壓片進行掃描，獲得樣品的紅外譜圖。

1.3.2水提醇沉提取物的制備取本品粉末約0.3 g，精密稱定，加水200 mL，加熱回流2 h，放冷，轉移至250 mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液2 mL，置15 mL離心管中，精密加入無水乙醇10 mL，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（轉速為4 000 r/min）20 min，棄去上清液（必要時過濾），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀烘干即得。將烘干粉末進行溴化鉀壓片，紅外光譜掃描。

1.3.3無水乙醇提取物的制備精密稱取樣品2.0 g，置于三角瓶中，加100 mL無水乙醇，然后將樣品超聲（40 Hz，常溫）10 min，超聲之后進行離心（4 500 r/min，20 min），取上清液，濃縮后進行紅外光譜掃描。

1.4數據處理紅外圖譜采用Spectrum V6.3.5操作軟件，對樣品進行數據采集和圖譜預處理，預處理過程包括基線校正和比對；二階導數譜采用Spectrum v6.3操作軟件，13點平滑。

2　結果與分析

2.1金釵石斛藥材粉末的紅外光譜主體成分解析將金釵石斛藥材粉末、油類和淀粉標品一維紅外光譜進行對比，見圖1，金釵石斛主要吸收峰的振動方式和峰歸屬見表1。從圖中可以看到，油類標品具有 3 個特征峰（2926cm-1、2854cm-1、1745cm-1），金釵石斛中 2 923 cm-1、2 855 cm-1、1 738 cm-1特征峰與油類這3個特征峰出峰位置相近，但峰形存在一定的差別。在1 200 cm-1以下，1 159 cm-1、1 106 cm-1、1 076 cm-1、1 035 cm-1，這組峰的位置與形狀與淀粉標品 1 155 cm-1、1 081 cm-1、1 019 cm-1位置的階梯峰相似，同時金釵石斛紅外譜圖中，在950 cm-1以下，還有糖環骨架振動吸收等多個指紋特征峰。由于藥材譜圖與標品譜圖所對應的特征峰較少，初步推測金釵石斛含有油類和淀粉類成分。

圖1　金釵石斛原藥材（a）油類和（b）淀粉標品（c）紅外光譜譜圖Fig.1　FT-IR spectra of Dendrobium(a),oil(b),starch(c),and nobile samples

表1　金釵石斛各吸收峰官能團的振動方式和主要峰歸屬Tab.1　vibration mode of absorption peak functional and the main peak attributable of Dendrobium nobile

二階導數譜能夠將一維紅外光譜的重疊峰分開，進一步提高譜圖的分辨率，使吸收峰的位置更加準確。將金釵石斛、油類標品一維譜圖進行二階求導，得到二階導數圖譜（圖2）。從圖中可見，3 000～1 600 cm-1波段內，油類標品在 2 960 cm-1、2 925 cm-1、2 852 cm-1、1 751 cm-1、1 738 cm-1處出現5個特征峰，而金釵石斛在2 920 cm-1、2 851 cm-1、1 737 cm-1處的吸收峰與油類中2 925 cm-1（亞甲基—CH2伸縮振動）、2 852 cm-1（亞甲基—CH2伸縮振動）、1 738 cm-1（酯羰基C=O伸縮振動）處的吸收峰在二階導數紅外光譜上位置接近，相差波數為5、1、1，并且峰形相似。

圖2　金釵石斛（a）油類（b）二階導數紅外光譜譜圖Fig.2　SD-IR spectra of Dendrobium(a)and oil(b)nobile samples

金釵石斛與淀粉標品的二階導數光譜圖見圖3，在1 800～1 000 cm-1的波段范圍內，金釵石斛中1467cm-1、1334cm-1、1202cm-1、1163cm-1、1126cm-1、1 108 cm-1、1 078 cm-1、1 056 cm-1吸收峰與淀粉中1462cm-1、1333cm-1、1206cm-1、1155cm-1、1125cm-1、1 107 cm-1、1 079 cm-1、1 054 cm-1等吸收峰位置相似。同時在二階導數譜中，隨著分辨率增高，芳香類成分的指紋特征峰位置更為明顯，發現金釵石斛的二階導數光譜有 1 593 cm-1、1 559 cm-1、1 508 cm-1芳香環骨架伸縮振動的吸收峰，還有1 737 cm-1、1 635 cm-1等C=O伸縮振動吸收峰。二階導數譜圖的比對，再次明確金釵石斛中含有脂類和淀粉類成分，并含有芳香類物質。

金釵石斛二階導數圖譜中在1 318 cm-1附近有強吸收峰，猜測可能為草酸鈣的吸收峰，為了確定石斛中是否含有草酸鈣成分，進一步將金釵石斛原藥材粉末與草酸鈣標品的二階導數譜圖進行比對，見圖4。發現草酸鈣有2個特征強峰，1 318 cm-1和782 cm-1，金釵石斛中 1 318 cm-1、763 cm-1吸收峰和草酸鈣中特征強峰在二階導數紅外光譜上位置一致，說明金釵石斛中都含有草酸鈣成分。

圖3　金釵石斛（a）和淀粉標品（b）二階導數紅外光譜譜圖Fig.3　SD-IR spectra of Dendrobium(a)and starch(b)nobile samples

圖4　金釵石斛（a）和草酸鈣（b）標品二階導數紅外光譜譜圖Fig.4　SD-IR spectra of calcium Dendrobium(a)and oxalate(b)nobile samples

2.2金釵石斛水提醇沉提取物的紅外光譜主體成分解析采用中國藥典中提取金釵石斛多糖的方法提取金釵石斛原藥粉，提取物進行紅外光譜掃描，對比金釵石斛水提醇沉提取物和金釵石斛原藥粉的一維紅外圖譜，見圖5。提取物的出峰位置和原藥材有明顯差異，并且提取物的峰數明顯少于原藥材，說明化學成分種類減少，提取物和原藥粉具體特征峰的出峰位置見表2。金釵石斛水提醇沉提取物中1 741 cm-1與1 651 cm-1附近的相對峰強度有明顯變化，提取后1 741 cm-1附近的峰強度接近1 651 cm-1附近的峰強度；糖區的各個特征峰強度也明顯增強，說明金釵石斛水提醇沉后粗多糖含量明顯增多，這也說明金釵石斛多糖多為水溶性糖；并且出現了1 080 cm-1附近特征峰，說明金釵石斛多糖多以糖苷的形式存在。

圖5　金釵石斛水提醇沉提取物（a）和金釵石斛原藥粉（b）紅外光譜圖Fig.5　FT-IR spectra of the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a)and Dendrobium nobile samples(b)

金釵石斛水提醇沉提取物和原藥材粉末二階導數譜圖，見圖6，可見特征峰的差異更加明顯，具體的出峰位置見表3。金釵石斛水提醇沉提取物在1 800～1 000 cm-1波段范圍內，共有2個強峰，1 158 cm-1和1 079 cm-1，其中1 079 cm-1是最強峰，中強峰2個分別為1 747 cm-1和1 020 cm-1，弱峰若干；金釵石斛原藥粉有2個強峰，1 467 cm-1和1 163 cm-1，其中1 163 cm-1為最強峰，中強峰8個分別為 1 737 cm-1、1 593 cm-1、1 508 cm-1、1 421 cm-1、1 376 cm-1、1 126 cm-1、1 078 cm-1和 1 056 cm-1，弱峰若干，并且在該波段內峰形、峰位置、峰強度都有顯著差異。1 600～1 300 cm-1波段內，提取物出峰數量明顯減少且峰強較原藥材小，說明提取物中芳香類成分含量減少。

圖6　金釵石斛水提醇沉提取物（a）和金釵石斛原藥粉（b）二階導數紅外光譜圖Fig.6　SD-IR spectra of the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a)and Dendrobium nobile samples(b)

金釵石斛水提醇沉提取物與淀粉標品的一維紅外光譜譜圖見圖7。金釵石斛提取物峰1156cm-1，1080cm-1，1022cm-1與淀粉標準譜圖參考峰 1155cm-1、1081cm-1、1019cm-1相似，兩者的相差波數為 1、1、3，且金釵石斛提取物紅外光譜形狀與淀粉標品譜圖相似，因此可以推斷金釵石斛多糖多為淀粉成分。具體出峰情況見表4。并且把金釵石斛水提醇沉提取物和淀粉標品進行相關系數分析，取糖區1 200～1 000 cm-1波段，把金釵石斛水提醇沉提取物和淀粉標品譜圖進行相關系數分析，金釵石斛與淀粉標品的相關系數為0.945。

表2　金釵石斛水提醇沉提取物和金釵石斛原藥粉特征峰的出峰位置Tab.2　Position of characteristic peaks of Dendrobium nobile samples and the water extraction and alcohol precipitation extract samples cm-1

表3　金釵石斛水提醇沉提取物和金釵石斛原藥粉二階導數特征峰的出峰位置Tab.3　Position of the second derivatine characteristic peaks of dendrobium nobile somples and the water extraction alcohol precipitation extract samples cm-1

圖7　金釵石斛水提醇沉提取物（a）和淀粉標品（b）紅外光譜圖Fig.7　FT-IR spectra of starch(b)and the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a)

由金釵石斛水提醇沉提取物及淀粉標品紅外光譜二階導數可見，金釵石斛與淀粉標品重疊峰更多，且峰形也更為接近，尤其在1 000～1 200 cm-1波段內，金釵石斛峰 1 158 cm-1、1 104 cm-1、1 079 cm-1、1 056 cm-1、1 020 cm-1與淀粉峰 1 155 cm-1、1 125 cm-1，1 107 cm-1、1 079 cm-1、1 054 cm-1，1 019 cm-1位置非常相似，再一次證明金釵石斛水提醇沉提取物多為淀粉成分，見圖8。具體的出峰位置見表5。通過以上分析可知金釵石斛水提醇沉提取物大部分是淀粉成分。

2.3金釵石斛無水乙醇提取物的紅外光譜主體成分解析將金釵石斛無水乙醇提取物進行紅外光譜掃描，并將無水乙醇提取物、水提醇沉提取物以及原藥材粉末的一維紅外圖譜進行比對，見圖9。無水乙醇提取物在2 925 cm-1、2 853 cm-1位置峰強明顯高于原藥材在2 923 cm-1、2 855 cm-1處的峰強，可以認為無水乙醇提取物中脂肪類成分含量高于原藥材。而無水乙醇提取物在1 200～1 000 cm-1糖區段內出峰數量明顯少于水提醇沉提取物，說明無水乙醇提取物中多糖含量較少。具體的特征峰出峰位置見表6。

圖8　金釵石斛水提醇沉提取物（a）和淀粉（b）標品的二階導數紅外光譜圖Fig.8　SD-IR spectra of starch(b)and the water extraction and alcohol precipitation extract samples(a)

將金釵石斛無水乙醇提取物與油類標準品一維紅外譜圖進行比對，見圖10，具體出峰位置見表7。金釵石斛無水乙醇提取物在2 925 cm-1、2 853 cm-1、1 735 cm-1、1 462 cm-1位置處出峰。石斛藥材無水乙醇提取物中的特征峰與脂肪類成分參考峰越接近，且能對應的峰個數越多，則該藥材中脂類含量越高，因此，金釵石斛無水乙醇提取物中脂類成分含量相對大。

表4　金釵石斛水提醇沉提取物以及淀粉標品特征峰的出峰位置Tab.4　Position of characteristic peaks of starch and the water extraction and alcohol precipitation extract samples cm-1

表5　金釵石斛藥材水提醇沉提取物與淀粉標品二階導數紅外光譜特征峰的出峰位置Tab.5　Position of SD-IR character peaks of Dendrobium nobile water extract alcohol precipitation sample and the starch cm-1

圖9　金釵無水乙醇提取物（a）、水提醇沉提取物（b）和原藥材（c）紅外光譜圖Fig.9　FT-IR spectra of the anhydrous ethanol extract samples(a)the water extraction and alcohol precipitation extract samples(b)and Dendrobium nobile samples(c)

圖10　金釵石斛無水乙醇提取物（a）和油類（b）紅外光譜圖Fig.10　FT-IR spectra of oil(a)and the anhydrous ethanol extract samples(b)

3　討論與結論

從金釵石斛原藥材和不同提取物的一維紅外光譜分析可知，原藥材和提取物含有相似的特征峰，如2 920 cm-1（亞甲基—CH2伸縮振動）、1 737 cm-1（酯羰基C=O伸縮振動）附近的特征峰、1000～1200cm-1（C-O伸縮振動）波段內的特征峰，可以初步判定金釵石斛中有多糖、脂類、芳香類化合物，并且通過與標準品的比對確定有淀粉類和油類物質。一維紅外圖譜在一定程度上存在著重疊峰，致使一些特征峰被隱藏，而二階導數譜可以使隱藏峰顯露，對于整體結構解析更為完整。通過二階導數譜進一步佐證了以上的實驗結果，同時在原藥材的二階導數譜中，可以觀察到1 318 cm-1和763 cm-1的吸收峰，該吸收峰分別為草酸根負離子中C-O鍵的對稱伸縮振動和彎曲振動，表明金釵石斛具有草酸鈣的特征峰，而草酸鈣是植物生長發育過程中次級代謝產物，廣泛分布于植物細胞中，這樣的變化說明二階導數譜相較于一維譜圖更全面。不同提取方式所提取的物質含量存在極大的差別，通過特征峰峰強可以簡單快捷地判斷某種物質的含量。水提醇沉提取物紅外譜圖證明了金釵石斛中含有大量的水溶性多糖，且主要以淀粉形式存在。而無水乙醇提取物的譜圖則證明了金釵石斛中脂類相對含量較大，完美體現了“相似相溶”的原則。

金釵石斛現不僅作為藥典記載的石斛藥材來源之一，同時也是藥食同源的藥材，更是保健品市場研究的熱點，故市場中金釵石斛摻假的現象屢見不鮮，目前市場中把蘭科金石斛屬、石仙桃屬和石豆蘭屬數十種植物也作為中藥石斛混入商品流通及藥用石斛混種混收等現象依然存在。出現這些問題的主要原因在于藥用石斛鑒定方法不夠完善，鑒定指標不夠明確。本實驗采用紅外光譜法結合二階導數分析技術獲得金釵石斛的整體結構信息，為今后系統完整的石斛鑒定研究打下了基礎，也為基原相近、易混淆的中藥鑒別提供了一個可發展的方向，同時為中藥材不同提取物的鑒別提供了思路。

表6　金釵石斛無水乙醇提取物、水提醇沉提取物和原藥材紅外圖譜特征峰的出峰位置Tab.6　Positions of FT-IR character peaks of the anhydrous ethanol extract samples,the water extraction and alcohol precipitation extract samples and Dendrobium nobile samples cm-1

表7　金釵石斛無水乙醇提取物和油類標品紅外圖譜特征峰的出峰位置Tab.7　Positions of character peaks of oil and the anhydrous ethanol extract samples cm-1

紅外光譜與二階導數譜圖的結合，能夠對金釵石斛進行整體分析，并且通過對不同提取譜圖的研究，能觀察到金釵石斛中化學成分的整體變化，有助于對藥材進行整體的質量控制和鑒別，并且本實驗在對原藥材進行研究同時，增加了對不同提取物的研究，使得整體分析更為全面。本研究結果證明紅外光譜整體結構解析與鑒定方法用于石斛這類價格昂貴、資源獲得困難的中藥材非常適合，其應用對于實現石斛藥材快速鑒別及質量評價與控制具有非常重要的意義。