TSLP-OX40信號通路對哮喘小鼠氣道重塑的影響及地塞米松的干預作用＊

宮靜，吳根英，高修霞

(廣東省第二中醫院呼吸內科，廣州 510095)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種炎癥細胞介導共同參與的慢性氣道炎癥性疾病，目前公認Th2細胞在哮喘氣道和肺組織的募集、浸潤是引起病理改變的關鍵。氣道炎癥反復發作可引起氣道重塑。氣道重塑導致了氣道不可逆阻塞和持續的氣道高反應性，從而令哮喘疾病變得更為難治[1]。多種信號通路參與哮喘發病，例如ERK1/2通路[2]，NF-kB信號通路[3]。胸腺基質淋巴細胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是類白細胞介素7的細胞因子，來源于上皮細胞，在哮喘患者的氣道平滑肌束中表達增加，它可以使肥大細胞活化，生成大量的趨化因子和細胞因子[4]。研究發現，哮喘TSLP表達水平和病情的嚴重度成正相關[5]。OX40/OX40L(OX40配體)協同刺激通路能夠促進CD+T細胞活化、增殖、遷移以及記憶性T細胞的形成，并在Th1細胞和Th2細胞的極化中起關鍵作用，與哮喘關系密切[6]。OX40的表達是TSLP誘導成熟的樹突狀細胞，促使Th0細胞分化成Th2細胞能力的非常重要因素[7]。TSLP-OX40信號通路在慢性哮喘小鼠氣道重塑的研究不多，本研究通過建立小鼠慢性哮喘模型，研究TSLP、OX40在支氣管哮喘小鼠肺組織中的表達及地塞米松對其表達的調節作用，進一步探討TSLP-OX40信號通路在氣道重塑中的作用。

1　材料與方法

1.1材料 SPF級BALB/C雌性小鼠，體重為17-20g，購買于廣東省醫學實驗動物中心；卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)(Sigma 公司)；地塞米松注射液(湖北天藥藥業股份有限公司，產品批號：51703251)；TSLP抗體(Abclonal公司)；OX40多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1哮喘模型的建立 30只SPF級BALB/C雌性小鼠隨機分3組，分別為對照組、哮喘組和地塞米松組(地米組)，每組各10只。參考文獻[8]建立慢性哮喘小鼠動物模型，每只哮喘組和地米組小鼠于第 1d，第 14d腹腔注射 0.2ml致敏液 (含OVA10μg，氫氧化鋁凝膠 100μg)，從第 21d 開始，霧化吸入OVA溶液（2.5%）30min，每周3次，造模時間共8周。地米組在每次霧化OVA前0.5h腹腔注射地塞米松，地塞米松使用劑量按10mg/kg計算。對照組以0.9%氯化鈉注射液代替OVA。造模及用藥過程觀察動物的一般狀況，如精神狀態、有無氣喘、進食量和大小便等情況。

1.2.2標本采集處理 造模結束后，對小鼠氣管插管，在右主支氣管處結扎右肺，用0.3ml冰磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進行左肺支氣管肺泡灌洗3次，以回收液體量>80%計為合格，4℃，1000r/min離心15min后，用血細胞計數板對沉渣進行細胞分類及計數。離斷頸椎處死小鼠后，留取左肺組織用多聚甲醛固定，行蘇木素-伊紅(HE)染色。右肺組織保存于-70℃冰箱備用提取總蛋白。

1.2.3肺組織切片HE染色 多聚甲醛固定后的組織脫水透明、浸蠟包埋；包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，厚度為5μm，每份標本切3片；脫蠟水化；Gill改良蘇木精液5min左右；自來水洗1min，75%鹽酸乙醇分化30s，自來水洗1min；加酸化伊紅乙醇液1-2min；脫水、透明和封固。

1.2.4氣道壁厚度及平滑肌厚度測定 使用Leica顯微鏡觀察HE染色的肺組織切片，挑選有完整橫斷面不含軟骨的支氣管進行測量，采用圖像分析軟件IPP6.0分別測量支氣管平滑肌面積(airway smooth muscle area，Wam)、 支 氣 管 管 壁 總 面 積(bronchial wall area，Wat)以及支氣管基底膜周徑(length of basement membrane，Pbm，)。 并用 Pbm 對Wam、Wat進行標準化，以Wam/Pbm代表平滑肌厚度、Wat/Pbm代表氣道壁厚度。

1.2.5Western blot檢測肺組織中TSLP蛋白、OX40蛋白 稱取肺組織，測蛋白總濃度，10%SDSPAGE，各樣品上樣量50ug，轉移至硝酸纖維素膜，4℃封閉過夜，分別加一抗 TSLP、β-actin，平搖、洗膜，加二抗，化學發光。計算TSLP與內參的比值作為TSLP蛋白的相對表達水平。OX40蛋白測定步驟基本同TSLP蛋白。

1.3統計學分析 數據用（x±s）表示，采用SPSS 19.0統計軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析，兩變量的相關分析采用Bivariate過程的等級Pearson相關法。所有統計數據以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1動物一般情況 哮喘組小鼠和地米組小鼠激發后均有伏地不動、呼吸加深加快表現，哮喘組還存在腹部鼓動明顯、口唇紫紺、排泄物增多的癥狀，對照組無上述表現。

2.2小鼠BALF炎癥細胞分類和計數 哮喘組小鼠細胞總數、淋巴細胞計數、中性粒細胞計數和嗜酸粒細胞計數均較對照組增多(P<0.05)；地米組細胞總數、淋巴細胞計數、中性粒細胞計數和嗜酸粒細胞計數較哮喘組有所下降，但仍比對照組增高(P<0.05，表 1)。

表1　3組小鼠BALF細胞總數和分類計數(×104ml-1，x±s)

2.3HE染色結果 鏡下可見對照組小鼠肺組織形態正常，支氣管上皮完整、無明顯炎癥浸潤。哮喘組小鼠支氣管及血管周圍大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞為主，肺間質也可見嗜酸性粒細胞存在，黏膜皺褶增多，黏膜下層增寬，氣管管腔縮小，平滑肌增厚明顯(圖1A、B)；地米組上述表現較哮喘組明顯減輕(圖1C)。見圖1。

圖1　小鼠肺組織病理學變化（HE，×400)

2.4支氣管壁厚度(Wat/Pbm)、平滑肌層厚度(Wam/Pbm)比較 哮喘組Wat/Pbm、Wam/Pbm較對照組增加，差異有統計學意義(P<0.05)；地米組Wat/Pbm、Wam/Pbm低于哮喘組，兩組相比，差異有統計學意義(P<0.05，表 2)。

表2　各組小鼠Wat/Pbm、Wam/Pbm比較(x±s，n=10)

2.5肺組織TSLP蛋白、OX40蛋白的表達 應用Western blot檢測發現，對于TSLP蛋白，哮喘組(1.19±0.12)高于對照組(0.26±0.10)(P<0.05)；地米組(0.90±0.15)低于哮喘組高于對照組，均有統計學差異(P<0.05)。對于 OX40 蛋白，哮喘組(0.88±0.10)高于對照組(0.23±0.05)，地米組(0.49±0.07)低于哮喘組高于對照組，上述差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2　3組小鼠TSLP蛋白、OX40蛋白的表達

2.6相關性分析 小鼠肺組織TSLP蛋白表達量與支氣管的管壁厚度、平滑肌厚度呈正相關(相關系數分別為 0.867、0.847，P=0.000)；肺組織的 OX40蛋白水平與TSLP蛋白表達呈正相關 (相關系數分別為 0.869，P=0.000)。

3　討論

哮喘的本質是氣道慢性炎癥，多種炎癥介質和細胞因子構成了一個與炎癥細胞相互作用的復雜網絡，使粘液分泌增加，血管滲出增多，氣道收縮痙攣，導致氣道反應性增高。普遍認為輔助性T淋巴細胞的兩種亞型Th1/Th2失衡是哮喘發病的重要機制，主要表現為Th1亞群功能降低和數目減少，Th2亞群功能亢進和數目增多。Th2細胞在哮喘肺組織和氣道的募集、浸潤即Th2反應亢進是引起哮喘病理改變的關鍵。慢性炎癥反復刺激和上皮結構的破壞組織增生可以引起哮喘的氣道重塑，使得哮喘疾病的治療更加棘手。在不同嚴重程度哮喘的大氣道和小氣道都可能存在氣道重塑[9]。

近年來的研究表明，TSLP可促進Th2型免疫應答，是啟動人類多種過敏性疾病，如哮喘、過敏性皮炎等的重要因子。TSLP誘導氣道炎癥，參與氣道重塑，拮抗TSLP可明顯減輕氣道炎癥，有人把他形象的比喻成氣道炎癥和氣道重塑的總開關[10]。OX40L的表達是TSLP誘導成熟的DC，使初始T細胞分化成Th2細胞能力的非常重要的因素[8]。對比使用TSLP、PolyIC和CD40L激活的DC，發現只有TSLP-DC可以在分子和蛋白質水平上均表達OX40L11]，OX40L屬于TNF超家族，而OX40則屬于TNF受體超家族成員，主要表達于活化的CD4+T細胞表面，OX40/OX40L在Th細胞增殖分化中有著重要作用。通過阻斷OX40可以抑制Th2相關型抗體IgG和IgE的產生[11]。我們參考文獻通過OVA致敏和激發，成功制作了小鼠慢性哮喘模型，并設立生理鹽水誘導的正常小鼠做對照。研究表明，癥狀表現方面，哮喘小鼠的陽性特征最為明顯，出現了腹部鼓動明顯、口唇紫紺、排泄物增多的癥狀。從病理學方面，觀察到存在明顯的氣道炎癥和氣道重塑特征，其主要的變化包括氣道壁炎性細胞浸潤、黏液分泌增多，氣道壁厚度和氣道平滑肌厚度的增加。給予地塞米松處理后，無論從癥狀表現方面，還是在病理改變方面都有明顯改善。實驗表明，哮喘組小鼠TSLP蛋白表達較對照組相比是上調的，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，OX40蛋白表達較對照組也明顯增加 (P<0.05)，地塞米松藥物可抑制TSLP和OX40蛋白的表達 (P<0.05)。通過相關性分析，TSLP與OX40兩者呈正相關。哮喘組小鼠TSLP可能通過OX40信號轉導途徑促進了Th2細胞的分化。

目前公認糖皮質激素是控制及預防哮喘發作最有效的藥物，可抑制遲發反應和氣道高反應性，抗炎作用明顯，臨床應用廣泛，已成為治療哮喘的一線藥物。我們的研究發現地米可減輕哮喘小鼠的氣道炎癥和氣道重塑，TSLP與OX40蛋白的表達較哮喘組也是下降的，由此推斷TSLP-OX40信號通路可能是糖皮質激素作用的靶點。作為本課題的延伸，下一步計劃敲除TSLP基因，觀察OX40/OX40L表達及Th2細胞因子的變化來進一步探討哮喘的發病機制。