益母草堿對窒息新生大鼠心肌損傷的保護作用及機制研究＊

張麗娜，吳星恒，王平，梁瑩

(1、南昌大學第一附屬醫院兒科，南昌 330006；2、南昌市第五醫院，南昌 330001；3、江西省兒童醫院，南昌 330006)

APJ本質上屬于蛋白的一種，與血管緊張素Ⅱ型受體之間有密切的關系并且APJ也能夠與G蛋白聯合發生作用，APJ有一種配體，即Apelin，其來源上屬于內源性。Apelin/APJ系統在體內分布廣泛，在多組織器官尤其是心血管系統和脂肪組織中高度表達。Apelin具有增加心肌收縮力、降壓、舒張血管、抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的心肌細胞肥大、阻止活性氧簇(ROS)依賴的心肌細胞肥大等重要的心血管保護作用[1]。但其在心血管疾病中的表達研究得出的結論不一。

益母草堿是從益母草中提煉的具有生物學作用的一種物質，益母草之所以可以保護心肌，就是因為益母草堿的存在，具有抗血小板聚集、降低血液粘稠度、舒張血管、增加血流量等作用。近年來，益母草堿對缺氧缺血損傷心肌的保護作用已引起研究者們的廣泛關注。

本課題組應用新生鼠建模，并通過對新生鼠的相關指標進行監測，確定心肌受損的程度，并同時對Apelin/APJ蛋白的表達進行分析與評估，探討窒息新生鼠心肌缺氧缺血損傷病理生理機制是否與內源性Apelin/APJ有關；藥物益母草堿干預后能否起到心肌保護作用并探討其機制。

1　材料與方法

1.1研究對象的分組 選取實驗動物 （新生鼠）共計72只，并按體重的大小進行編號處理，采取隨機的方式進行分組：共分成3個大組，即正常組、窒息組、益母草堿組，每組24只，再按照處理時間點的不同將每個大組分成3個亞組，正常組分為30min亞組，60min亞組，120min亞組，每組8只實驗動物；窒息組也分為30min亞組，60min亞組，120min亞組，每組8只實驗動物；同樣益母草組也分成3個亞組，即30min亞組，60min亞組，120min亞組，每組8只實驗動物。

1.2建模的方法 取容量為55ml的密封的完整的磨口瓶，內置鈉石灰，質量大約5g，將窒息組的實驗動物置于其中，靜待片刻，等實驗動物安靜下來以后再開始實驗。在磨口瓶的瓶口涂上凡士林，并將磨口瓶密封，讓實驗動物處在缺氧的條件下并立即開始計時，時間持續0.5h，缺氧處理時間結束的時候進行復氧的操作，時間持續2h[2]。正常組的實驗動物采取相同的操作，但實驗過程中不將磨口瓶封閉，不缺氧；益母草堿藥物組窒息后立即予腹腔注射益母草堿5mg/kg[3]（藥物由天津馬克生物技術有限公司提供，A0539）。窒息組的實驗動物在進行缺氧處理以后立即腹腔注射5mg/kg生理鹽水。各組新生鼠分別于模型建立后30min、60min、120min分批取心臟血及心臟標本行各項指標的檢測（每個時間點8只）。

1.3相關指標的測定 將建模成功的實驗動物于30min、60min、120min 3個時間點應用戊巴比妥麻醉，并進行開胸處理，于心臟取血，0.3ml即可，用離心機分離，取0.1ml血漿，進行肌酸激酶和乳酸脫氫酶的測定，應用的設備應為通過檢測的全自動生化分析儀(Olympus)。

1.4組織的病理學檢查 將建模成功的實驗動物于30min、60min、120min 3個時間點于心尖部取適量的標本，經沖洗、濾干、以及固定等操作以后，應用石蠟進行包埋。制作成組織切片，以4-5μm為最佳。然后進行蘇木精-伊紅染色，于光鏡下觀察組織的病理學改變。

1.5ELISA法測定心肌組織Apelin及APJ蛋白表達 將所取的標本于-70℃的條件下保存。在進行檢測時，首先將標本放置于醋酸中，并將醋酸的濃度固定于0.1mol/L，不需要太多，2ml即可，加熱至100℃，并持續大約10min，然后應用離心機進行離心，條件為：3000r/min，時間大約持續15mim，然后取上層的提取液。應用ELISA法進行Apelin蛋白含量的測定（計量單位為濃度ng/L)及APJ蛋白含量(計量單位為濃度ng/ml），整個過程中要注意操作的流程一定要規范，可以參考試劑盒的說明進行。

1.6統計學分析 將所得的實驗數據錄入，并應用SPSS 13.0軟件進行對比與分析。計量資料用均值±標準差（x±s）表示，組間的分析采用方差分析，組內的分析應用SNK-q檢驗，P<0.05代表差別具備統計學意義，P＞0.05代表差別不具備統計學意義。

2　結果

2.1窒息后新生鼠的一般情況 窒息組及藥物組實驗鼠均表現為懶動、少吃。正常組新生鼠因未窒息缺氧，無上述表現。各組均無動物死亡。

2.2心肌組織病理學形態觀察（見圖1）

圖1　新生鼠心肌組織HE染色結果（×放大倍數）

2.3各組新生鼠血清CK濃度變化（見表1）

表1　新生鼠血漿CK濃度比較：（x±s，單位U/L）

2.4各組新生鼠血清LDH濃度變化（見表2）

表2　新生鼠血漿LDH濃度比較：（x±s，單位U/L）

2.5ELISA法檢測心肌組織Apelin的結果 （見表3）

表3　新生鼠心肌組織Apelin蛋白含量的比較：（x±s，單位ng/L）

2.6ELISA法檢測心肌組織APJ的結果（見表4）

表4　新生鼠心肌組織APJ蛋白含量值比較：（x±s，單位ng/ml）

3　討論

新生兒窒息是新生兒期危害極大的常見病，可引起新生兒致殘甚至死亡；新生兒窒息多數是由多因素共同作用的結果，也可由單一病因引起[4]。窒息后缺氧缺血可導致各臟器損傷，除腦損傷外[5]，其中合并心肌損傷在兒科臨床較為常見[6]，近年來進一步探索窒息缺氧所致缺氧缺血性心肌損傷機制及藥物防治已成為研究熱點。

本實驗通過建立新生鼠常壓窒息模型，觀察實驗鼠窒息后一般情況，測定血清CK、LDH等水平變化，并結合HE染色光鏡下心肌病理形態學的改變，通過藥物益母草堿進行干預，從整體水平評估窒息新生鼠心肌損傷情況及藥物的心肌保護作用。本研究發現，相比于正常對照組：模型組、藥物組實驗鼠均表現為懶動、少吃；血清CK、LDH水平升高，各時間點均高于正常對照組，且隨著缺氧缺血時間延長呈上升趨勢。與模型組相比：藥物組血清CK、LDH水平顯著下降，心肌損害程度明顯減輕，證實了益母草堿對窒息缺氧誘導的在體未成熟心肌損傷具有一定的保護作用，并進一步探討了可能的機制。

Apelin是近年來發現的一種生理調節肽，目前發現其主要是由脂肪細胞分泌，在循環系統中發揮主要的作用并具有重要的價值。目前對于Apelin在心血管疾病中的表達及作用，所得研究結論存在分歧。Tycinska等[7]、申健等[8]報道心梗患者循環apelin水平降低。與此相反，在缺氧的條件下，新生鼠體內的Apelin含量上升、表達增多，從而推測Apelin可能發揮代償性作用。與Heo K等[9]臨床觀察基本一致。國內張志等[10]通過制備在體和離體心肌缺血模型，證實在缺血早期，心肌組織Apelin含量代償性增高，長時間缺血時表達下降，此現象說明在發生心肌缺血尤其是在突發的條件下，內源性Apelin可以保護機體不受損傷；Rastaldo和Tempel等通過研究表明，Apelin對心肌局部缺血發揮保護作用，是通過促進新生血管、限制梗死面積等途徑實現[11，12]。本實驗研究結果表明，窒息新生鼠心肌組織Apelin早期表達增加，60min達高峰，120min后表達較前下降。推測早期心肌缺血，Apelin作為保護性因子，在心肌缺氧/缺血病理情況下，代償性表達增加以對抗心肌損害，但隨著時間推移，可能因代償不足而表達下降。

Zeng等[13]通過研究發現，在離體心肌缺血/再灌注大鼠模型中，缺血再灌注可引起APJ受體表達上調，外在給予Apelin后可明顯改善缺血/再灌注引起的心肌收縮及舒張功能障礙，可能與心肌組織中APJ受體表達上調有關。此外有研究表明，從某種意義上來說，缺氧可以誘導APJ mRNA和蛋白的表達，也有助于耐缺氧能力的提升[14]。本實驗研究結果表明心肌組織APJ的表達與Apelin一致，均呈現早期升高，晚期下降的曲線變化，表明早期心肌細胞缺氧缺血可以導致APJ的表達升高。窒息新生鼠心肌缺氧缺血損傷病理生理過程中，內源性Apelin/APJ可能發揮代償性保護作用。

中藥研究報道銀杏葉提取物、靈孢花子粉、參附湯抗大鼠心肌缺血損傷的機制可能與其增加心肌組織Apelin mRNA的表達，提高Apelin水平有關[15-17]。但本實驗結論與之相反，推斷益母草堿可能并非直接通過上調Apelin/APJ系統蛋白表達的機制發揮對未成熟心肌缺氧缺血性損傷的保護作用，可能與益母草堿的生物學作用相關，也可能是因為益母草堿進一步抑制了Apelin/APJ蛋白的代償性表達，從而導致Apelin/APJ蛋白含量下降。但其具體機制尚不明確，尚需進一步實驗研究。