PD-1/PD-L1的表達與鼻咽癌患者臨床分期及預后相關性研究

李鷹飛，邱華平，龍劍，查國華，饒曉軍，周慧霞

(江西省撫州市第一人民醫院，撫州 344000)

鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤之一，發病與EB病毒感染、化學致癌因素、環境因素、遺傳因素有關，具有腫瘤細胞分化較差和對放化療敏感等特點[1]。目前主要治療方法包括：單純放療、同期放化療+輔助化療、同期放化療和誘導化療+放化療綜合治療。盡管大部分鼻咽癌病人能夠得到治愈，但也有一部分病人治療失敗出現局部復發和遠處轉移。

PD-1（程序性死亡受體-1）主要表達在活化T淋巴細胞膜上。PD-L1（程序性死亡配體-1）主要表達在腫瘤細胞膜上，在腫瘤相關巨噬細胞和樹突狀細胞上亦有表達，是PD-1的配體。PD-1和PDL1的結合能抑制T細胞的活化及增殖，出現腫瘤免疫抑制和免疫逃逸，最終可能導致腫瘤復發及轉移。大量的報道表明，多種腫瘤組織中PD-1/PD-L1的表達與腫瘤患者分期和預后相關[2]。

本研究是通過免疫組化方法檢測鼻咽癌病理蠟塊組織中PD-1和PD-L1的表達，探討兩者與鼻咽癌患者臨床分期及預后關系。

1　材料與方法

1.1標本來源 共收集58例從2010年5月-2015年7月在江西省撫州市第一人民醫院通過電子鼻咽鏡活檢、福爾馬林固定、石蠟包埋組織病理檢查診斷為非角化型鼻咽癌的蠟塊標本，將放化療后電子鼻咽鏡活檢的鼻咽癌組織、鼻咽癌轉移淋巴結或其它部位轉移灶組織標本排除在外。所有標本對應的鼻咽癌患者經過常規放化療后均達到完全緩解。隨訪截至2017年6月份。

1.2免疫組化實驗步驟 ⑴鼻咽癌組織蠟塊4um厚切片；⑵二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；⑶3%H2O2室溫孵育10min，消除內源性過氧化物酶的活性；⑷蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min×2次；⑸微波加熱修復10min；⑹5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗，滴加一抗工作液，37℃孵育1h；⑺PBS沖洗，5min×3次；⑻滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育 30min；⑼PBS沖洗，5min×3次；⑽滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素（SABC）工作液，37℃孵育30min；⑾PBS沖洗，5min×3次；⑿DAB 室溫顯色 3min；⒀自來水充分沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3免疫組化評分標準 在光鏡下(×400)10個視野計數，每個視野計數100個細胞。根據陽性細胞所占百分比和陽性細胞染色強度兩個方面進行分析：⑴陽性細胞所占百分比（A）：無陽性細胞0分，陽性細胞百分比≤25%1分，陽性細胞百分比26%-50%2分，陽性細胞百分比51%-75%3分，陽性細胞百分比≥76%4分；⑵染色強度 (B)：無染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩種記分相乘結果≥1表示陽性表達。

1.4研究標本對應的患者臨床分期及預后 臨床分期參照美國癌癥聯合委員會（AJCC）鼻咽癌TNM分期系統（2010年第七版）。通過電話、復查方式進行隨訪，得到患者無疾病生存期（DFS）：從確診鼻咽癌開始至腫瘤復發轉移或最后一次隨訪的時間。隨訪截止時間為2017年6月。

1.5統計方法 采用SPSS 17.00軟件進行統計分析，使用χ2檢驗評價鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1的表達與分期的關系。使用Kaplan-Meier方法對鼻咽癌患者無疾病生存期進行生存分析。P＜0.05表示有統計學差異。

2　結果

2.1鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1表達情況 經過免疫組化方法檢測，58例鼻咽癌組織中PD-1的表達陽性率為31.0%（18/58），PD-L1的表達陽性率為 53.4%（31/58）。

2.2鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1表達與臨床分期的關系 58例鼻咽癌患者使用鼻咽癌AJCC TNM分期 （2010年第七版），與鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1表達進行χ2檢驗評價，PD-1表達與臨床分期無明顯相關（P＞0.05），PD-L1陽性表達較陰性表達 TNM 分期更晚（0.05＞P＞0.01）。

表1　鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1表達與臨床分期的關系

2.3鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1表達與患者無疾病生存期的關系 隨訪58例鼻咽癌患者，其中16例出現復發或轉移。在16例復發或轉移鼻咽癌患者中，有5例標本PD-1表達陽性，13例PD-L1表達陽性。通過Kaplan-Meier方法進行生存分析，PD-1陽性表達與陰性表達無疾病生存期無差異（P=0.825）；PD-L1陽性表達較PD-L1陰性患者無疾病生存期明顯縮短（P=0.009）。

3　討論

本研究的最終結論為：經常規放化療后達到完全緩解的鼻咽癌患者，PD-L1表達與臨床分期和無疾病生存期（DFS）有關，PD-1表達無明顯相關性。但在國內外有關鼻咽癌組織中PD-1/PD-L1的表達和臨床分期及預后相關性的多項研究中，結果并不完全一致。張峰等[3]報道，PD-L1在正常鼻咽組織中無表達，在鼻咽癌組織中表達陽性率為67.8%（40/59），PD-L1陽性表達與鼻咽癌患者的年齡、性別無明顯相關，與臨床分期及淋巴結轉移相關。Hsu等[4]使用免疫熒光染色方法分析PD-1在正常鼻咽組織和鼻咽癌組織中的表達，發現PD-1在鼻咽癌組織中CD8+T淋巴細胞上的表達明顯高于正常鼻咽組織（P＜0.0001），但與臨床分期無相關性，PD-1高表達鼻咽癌患者預后較差，無疾病生存期及總生存期縮短，局部復發增加（P值分別為 0.05、0.007 和 0.004）。 Zhang 等[5]報道，鼻咽癌組織中PD-1的表達陽性率為37.4%，PD-L1的表達陽性率為95%，PD-1/PD-L1的表達與年齡、性別、淋巴結轉移及分期無相關性，PD-1的表達對預后的影響不明顯（P=0.57），PD-L1高表達無疾病生存期明顯縮短，預后不良 （P=0.009），PD-1/PD-L1同時表達預后最差。本研究結果顯示，鼻咽癌組織中PD-L1陽性表達患者分期更晚，無疾病生存期明顯縮短，預后不良，阻斷PD-1/PD-L1通路的腫瘤免疫治療可能有效。但我們的研究為回顧性分析，樣本量較小，部分患者隨訪時間較短，需要進一步研究，為鼻咽癌針對PD-1/PD-L1通路的腫瘤免疫治療療效預測更好地提供理論依據。