間質性膀胱炎膀胱平滑肌RhoA/Rho激酶表達與膠原分泌的關系

葉雪挺 陳洪德 翁志梁

間質性膀胱炎（IC）臨床表現復雜多樣，儲尿期癥狀較重的患者常伴隨膀胱有效容量的降低，可能與膀胱纖維化及低順應性膀胱的形成相關。有研究認為［1］在膀胱纖維化過程中，組織中膠原蛋白特別是Ⅰ型膠原蛋白合成增加。有研究表明，RhoA/Rho激酶在人類和動物的膀胱平滑肌功能與結構方面起重要調節作用［2］。前期研究［3］顯示在IC大鼠模型中RhoA/Rho激酶途徑可能增加膀胱逼尿肌收縮的敏感性，從而參與IC的發生、發展。且Rho激酶可能參與調控心肌的纖維化［4］。有文獻報道［5］RhoA /Rho激酶通路與小鼠左心室重構有關，Rho激酶可促進小鼠心肌纖維化，長期抑制Rho激酶可顯著改善心室重構。本文探討IC患者膀胱平滑肌組織中RhoA/Rho激酶、I型膠原表達情況及相關性。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2012年10月至2016年12月本院IC患者24例（觀察組），其中男5例，女19例；平均年齡（49.3±11.4）歲。平均病程（74.6±16.4）個月。診斷符合美國糖尿病、消化及腎病協會（NIDDK）制定的IC診斷標準［6］。排除糖尿病、高血壓、精神病史、肝腎功能損害、膀胱相關感染性、免疫性疾病。根據盆腔疼痛和尿頻、尿急患者癥狀調查表評分（PUF評分），≤15分12例為低癥狀評分組；PUF評分＞15分12例為高癥狀評分組。另收集同期12例輸尿管膀胱再植手術患者正常膀胱組織為對照組，其中男2例，女10例，平均年齡（50.4±12.8）歲。與觀察組比較年齡無統計學意義（P＞0.05），所有入選患者均知情同意。

1.2 方法 （1）標本采集：觀察組硬脊膜外麻醉下行膀胱注水擴張時取膀胱組織活檢，活檢部位遠離潰瘍處。對照組為所取正常膀胱組織。將所取膀胱組織修剪為0.5cm×0.5cm×0.5cm的平滑肌組織，用生理鹽水沖洗后放入凍存管，迅速轉移至液氮內保存。（2）試劑及設備： TRIzol總RNA抽提試劑盒：美國MRC公司。逆轉錄試劑盒：美國Promega公司。實時熒光定量PCR試劑盒：美國Promega公司，Rotor-Gene 3000實時PCR檢測儀：澳大利亞Corbett Research公司。人Ⅰ型膠原蛋白、RHoA蛋白、ROCK I蛋白ELISA試劑盒：美國TSZ公司。PBS緩沖液：北京中杉生物技術公司。ELX800酶標儀：美國Bio-Tek公 司。（3）RT-PCR檢 測 RhoA mRNA、ROCK I mRNA水平：①總RNA提取：膀胱平滑肌組織按照TRIzol提取總RNA，用分光光度計測定純度。②合成DNA：按逆轉錄試劑盒說明書操作合成，RhoA上游引物為5'-CTGGTTGGGAATAAGAAGGAT-3'，下 游 引 物 為5'-CAGCAAGGTTTCACAAGACA-3'，產 物 大 小253bp；ROCK I上 游 引 物 為5'-AACTGATGGTAACCTCCCAGAGT-3'， 下 游引 物 為5'-GGATTGCTCCTTATCTTGTTCG-3'，產 物 大 小 159bp。β-actin上 游 引 物 為5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3'，下游引物為5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3'，產物大小 211bp。③分別擴增RhoA、ROCK I與β-actin：94℃變性

1min，52℃退火45s，72℃延伸1min，40個循環，最后72℃延伸7min。每一反應至少重復進行3次。④標準曲線制作：分別取各組逆轉錄后cDNA為模板，以10倍濃度梯度稀釋后分別行PCR反應。分析擴增曲線數據，獲取溶解曲線及定量標準曲線。⑤結果判斷：根據Ct值從標準曲線上讀取待測基因表達水平，并以此表達水平與參照物表達水平之比作為樣品中待測基因的相對表達水平。（4）ELISA法測定RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白含量：稱取膀胱平滑肌組織500mg，勻漿后將勻漿物于4℃，12000r/min離心10min。分別收集上清液-70℃冰箱保存，用于標本含量測定。檢測操作步驟嚴格按ELISA試劑盒說明書進行。采用酶標儀于450nm處讀取OD值，通過標準曲線獲得待測樣本RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白的表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，Levene檢驗法檢驗各總體方差齊性，方差不齊時采用Welch法進行校正。方差齊時各組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗，方差不齊時各組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

三組間RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達水平差異均有統計學意義（P＜0.01），見表1。三組間RhoA mRNA兩兩比較顯示對照組與低癥狀評分組間差異無統計學意義（P=0.093），高癥狀評分組與對照組、低癥狀評分組間差異有統計學意義（P＜0.01）。ROCK I mRNA兩兩比較顯示對照組與低癥狀評分組組間差異無統計學意義（P=0.590），高癥狀評分組與對照組、低癥狀評分組差異有統計學意義（P＜0.01）。RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。采用Pearson相關分析法計算RhoA mRNA與ROCK I mRNA 的相關系數 r=0.590（P＜0.01），RHoA 蛋白與ROCK I蛋白的相關系數r=0.737（P＜0.01），RHoA蛋白與Ⅰ型膠原蛋白的相關系數r=0.783（P＜0.01），ROCK I蛋白與Ⅰ型膠原蛋白的相關系數r=0.736（P＜0.01）。

表1 三組RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達水平（x±s）

3 討論

IC的發病機制至今尚未明確，臨床癥狀復雜多樣，尿頻、尿急、盆腔痛及夜尿增多等癥狀較常見。臨床上部分癥狀較重的患者行尿動力學檢查時發現膀胱順應性降低，膀胱最大容量減小的現象［7］，推測與膀胱纖維化有關。上述現象的出現，用目前被多數學者接受的膀胱上皮通透性異常假說尚難以解釋。近年來，有研究發現［8］RhoA/Rho激酶途徑在調節大鼠及人類膀胱逼尿肌收縮中起重要作用。當細胞接受到信號刺激時，激活胞質內的RhoA，進而激活其下游的Rho激酶。Rho激酶又稱為Rho相關激酶（ROCK），是RhoA下游最主要 、最具特色的效應器［9］，存在著多種磷酸化和去磷酸化的作用，有ROCK I和ROCK II兩個亞型，研究［10］表明，在內臟平滑肌組織中主要起作用的是ROCK I。ROCK I激活后可抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）活性，提高肌球蛋白ATP酶的活性，改變調節性蛋白對鈣離子的敏感性，增強平滑肌的收縮敏感性［11］。除此以外，ROCK I激活后還可以通過抑制一氧化氮的產生、抑制神經血管再修復等可能途徑導致膀胱過度活動［12］。

膀胱平滑肌組織纖維化是膀胱功能由代償向失代償轉變的重要過程。近年來有研究［13］表明，RhoA/Rho激酶途徑與心肌纖維化相關。小分子Rho酶家族除增加平滑肌細胞收縮敏感性外，也可參與調節細胞的遷移、聚集、粘附、增殖等功能。有研究發現［4］，Rho激酶可能參與調控大鼠心肌肥厚與血管平滑肌肥大，另有文獻［5］指出RhoA/Rho激酶途徑與小鼠心血管重構及心肌梗死后的左心室重構有關，特異性抑制劑抑制Rho激酶后可改善重構程度。應用基因敲除技術，有研究［14］認為Rho激酶的同源異構體形式ROCK1在心肌纖維化中起重要作用。根據以上研究結果，作者推測RhoA/Rho激酶途徑可能與IC疾病進展過程中的膀胱纖維化相關。本資料結果顯示，對照組、低癥狀評分組、高癥狀評分組組間RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達水平均有顯著性差異，RhoA mRNA與ROCK I mRNA、RHoA蛋白與ROCK I蛋白、RHoA蛋白與Ⅰ型膠原蛋白、ROCK I蛋白與Ⅰ型膠原蛋白間均存在正相關。提示IC患者存在膀胱平滑肌組織纖維化現象，且纖維化程度與臨床癥狀水平相關，臨床癥狀水平越高，纖維化程度也越重。在纖維化過程中明顯上調RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白的表達水平，提示IC患者膀胱纖維化過程中RhoA/Rho激酶途徑被活化。推測IC患者膀胱纖維化至少部分是通過RhoA/Rho激酶信號通路介導的。

當然RhoA/Rho激酶信號通路可能不是IC患者膀胱纖維化過程中唯一參與的信號轉導通路。在心肌纖維化的研究中，有學者指出酪氨酸激酶途徑、轉化生長因子β（TGF-β）均可能參與引起心肌纖維化［15］。IC患者膀胱纖維化是一個復雜的過程，還有那些信號通路、信號轉導因子參與其中，有待進一步研究。