雷公藤紅素通過上調PTEN的表達提高順鉑對Hep3B干細胞的凋亡誘導活性

上官醉飛 毛其芬?

腫瘤干細胞是腫瘤組織細胞群體中一群有干細胞特征的特殊腫瘤細胞，表達CD133、Bmi-1和Oct4等干細胞表面標志。文獻報道相比常規腫瘤細胞，這群腫瘤干細胞對化療的敏感性較低，因此這群有較強自我更新能力的腫瘤干細胞是造成化療失敗和腫瘤復發的重要因素［1-2］。順鉑是治療肝癌的有效藥物，然而肝癌干細胞對順鉑的高度抵抗性常造成化療的失敗［3］，本研究探討雷公藤紅素是否能提高順鉑對肝癌干細胞的殺傷活性。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）試劑：順鉑、雷公藤紅素、噻唑藍［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5- diphenyltetrazolium bromide，MTT］、凋亡檢測試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。DMEM培養基購于美國Gibco。蛋白提取液、PTEN、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、活化caspase-3、Bad、Bcl-2、Bcl-xl和β-actin.兔抗人抗體購于美國Cell Signaling。CD133-FITC熒光抗體購于美國BD公司。PTEN siRNA（正向 ： GCACAAGAGGCCCUAGAUUTT，反向： AAUCUAGGGCCUCUUGUGCTT）購于上海吉瑪生物。Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen。ECL試劑盒購于美國Pierce。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠購于美國Santa Cruz。（2）細胞培養：人肝癌細胞系Hep3B購于中科院上海細胞庫。Hep3B腫瘤干細胞用流式細胞儀進行分選，CD133陽性的Hep3B細胞即為Hep3B腫瘤干細胞［4］。分選后的Hep3B腫瘤干細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃恒溫培養箱中培養，通入5% CO2。Hep3B腫瘤干細胞傳代1次/2～3d，傳代時，用胰酶消化液使細胞進入懸浮狀態并用DMEM培養基洗滌2次，將細胞懸液按1：3稀釋后傳代。

1.2 方法 （1）PTEN siRNA轉染：使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟將50 pmol/ml PTEN siRNA轉染入Hep3B腫瘤干細胞中，培養24h。（2）MTT法檢測雷公藤紅素和順鉑對Hep3B腫瘤干細胞細胞活力的影響 ：將Hep3B腫瘤干細胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組、順鉑組、雷公藤紅素組、順鉑+雷公藤紅素組及順鉑+雷公藤紅素+PTEN siRNA組，分組培養方法見表1。藥物處理時間為48h。處理完畢后在細胞培養基中加入20ml MTT（5mg/ml）培養4h，移除孔內培養基，加入100μl二甲亞砜，570nm波長下測定OD值。細胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD藥物處理組）/ OD對照組×100%。（3）免疫共沉淀：將Hep3B腫瘤干細胞按上述進行分組處理，用細胞裂解緩沖液進行裂解，12000r/min離心10min，收取上清液。上清液平均分成兩份，一份用作對照檢測β-actin的表達水平，另一份加入Bad抗體孵育過夜，之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2h。孵育完成后1200r/min離心5min，將瓊脂糖珠離心至管底，之后小心吸去上清液，瓊脂糖珠用免疫沉淀緩沖液洗滌2次后加入western blot上樣緩沖液，沸水浴煮5min后備用。用Bad蛋白免疫共沉淀與Bad結合的Bcl-2和Bcl-xl蛋白。（4）Western blot實驗：將Hep3B腫瘤干細胞按上述進行分組處理，之后用蛋白提取液提取總蛋白質。將總蛋白質或從（1）（2）（3）所述步驟中得到的免疫共沉淀蛋白用12%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉至PVDF膜上，用PTEN、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、活化caspase-3、Bad、Bcl-2、Bcl-xl或β-actin兔抗人抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。（5）細胞凋亡實驗：將Hep3B腫瘤干細胞按上述進行分組處理，之后按照凋亡試劑盒說明書步驟將碘化丙啶（PI）和Annexin-V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，Annexin-V陽性細胞即為凋亡細胞。

表1 Hep3B腫瘤干細胞實驗分組方法

1.3 統計學方法 采用SPSS 14.0統計軟件。所有實驗均重復3次，計量資料用（x±s）表示，兩組間比較用Student's t檢驗，多組間均數的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤紅素提高順鉑對Hep3B腫瘤干細胞的殺傷活性 順鉑和雷公藤紅素單獨處理對Hep3B腫瘤干細胞的殺傷活性較弱，兩者聯合后能顯著誘導Hep3B腫瘤干細胞發生死亡。Western blot實驗結果顯示雷公藤紅素處理能顯著上調Hep3B腫瘤干細胞中PTEN蛋白的表達水平，而順鉑處理對PTEN的表達水平無明顯影響。當轉染PTEN siRNA以阻斷雷公藤紅素對PTEN的誘導作用后，雷公藤紅素不能提高順鉑對Hep3B腫瘤干細胞的殺傷活性，表明雷公紅素可能通過上調PTEN的表達增強順鉑對Hep3B腫瘤干細胞的殺傷活性。見表2、圖1。

表2 雷公紅素增強順鉑對Hep3B腫瘤干細胞的殺傷活性（x±s）

圖1 雷公藤紅素上調Hep3B腫瘤干細胞PTEN蛋白的表達水平

2.2 雷公藤紅素通過上調PTEN的表達抑制PI3K和AKT的磷酸化 Western blot實驗結果顯示Hep3B腫瘤干細胞的PI3K和AKT磷酸化水平較高，順鉑單獨處理對PI3K和AKT和的磷酸化水平影響不大，Hep3B腫瘤干細胞用雷公藤紅素處理后，PI3K和AKT的磷酸化水平顯著下降。另外，轉染PTEN siRNA能顯著減弱雷公藤紅素對PI3K和AKT磷酸化的抑制作用，結果表明雷公藤紅素通過上調PTEN的表達抑制Hep3B腫瘤干細胞中PI3K/AKT通路的磷酸化。見圖2。

圖2 雷公藤紅素通過上調PTEN的表達抑制PI3K和AKT的磷酸化

2.3 雷公藤紅素通過促進Bad與Bcl-2、Bcl-xl的結合增強順鉑對Hep3B腫瘤干細胞的凋亡誘導效應 免疫共沉淀實驗結果顯示雷公藤紅素能顯著增強Bad蛋白與Bcl-2和Bcl-xl的相互作用（見圖3），從而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的活性。Western blot和MTT實驗結果顯示雷公藤紅素能顯著促進順鉑依賴的caspase-3的活化（見圖4）和凋亡的誘導（見圖5）。另外，轉染PTEN siRNA后順鉑聯合雷公藤紅素誘導的Bad與Bcl-2、Bcl-xl的相互作用和凋亡的發生均受到顯著抑制，表明雷公藤紅素通過上調PTEN的表達促進順鉑誘導的凋亡途徑。

圖3 雷公藤紅素顯著增強Bad蛋白與Bcl-2和Bcl-xl的相互作用

圖4 雷公藤紅素增強順鉑對Hep3B腫瘤干細胞caspase-3的活化

圖5 雷公藤紅素增強順鉑對Hep3B腫瘤干細胞的凋亡誘導活性

3 討論

肝癌干細胞的存在是造成肝癌細胞耐藥和化療后復發的重要因素，嚴重影響肝癌患者的預后［5］。順鉑是治療肝癌的有效藥物，其能阻斷腫瘤細胞DNA的修復從而啟動細胞凋亡程序［6］。然而肝癌干細胞的耐藥性顯著降低順鉑的療效，因此靶向于肝癌干細胞的輔助治療是提高順鉑抗腫瘤活性的有效方法。雷公藤紅素是一種三萜類化合物，來源于中藥雷公藤的根皮，具有多種生物活性。研究發現雷公藤紅素具有一定的抗腫瘤效應，能誘發腫瘤細胞自噬或凋亡性死亡［7-8］，然而雷公藤紅素在腫瘤干細胞中的作用，至今仍較少報道。在本資料中，雷公藤紅素能顯著提高順鉑對Hep3B腫瘤干細胞的殺傷活性，表明雷公藤紅素能減弱肝癌干細胞對化療的抵抗性。

PI3K/AKT途徑的過度活化是腫瘤增殖和存活的重要因素，PI3K和AKT的磷酸化受PTEN的調控。PTEN是一種已知的抑癌基因，能通過抑制PI3K/AKT信號通路阻斷腫瘤的發生。研究表明PTEN在多種腫瘤中表達失調，PTEN基因的突變或缺失是腫瘤發生的一個獨立危險因素［9-10］。本資料中，雷公藤紅素能上調肝癌干細胞中PTEN蛋白的表達，且雷公藤紅素通過上調PTEN的表達增強提高Hep3B腫瘤干細胞對順鉑的敏感性。

Bad是Bcl-2促凋亡蛋白家族成員，是AKT激酶的底物。PI3K/AKT途徑的過度活化能誘導Bad與Bcl-2或Bcl-xl發生解離，從而使Bcl-2和Bcl-xl游離出來發揮抗凋亡作用［11-12］。本實驗結果表明雷公藤紅素能上調肝癌干細胞中的PTEN表達水平，從而抑制腫瘤細胞的PI3K/AKT通路，使Bcl-2和Bcl-xl保持與Bad的結合從而抑制Bcl-2和Bcl-xl的抗凋亡活性，提高順鉑對肝癌腫瘤干細胞的凋亡誘導活性。

綜上所述，雷公藤紅素能顯著增強順鉑對肝癌干細胞的殺傷活性。作者認為雷公藤紅素上調PTEN的表達并抑制Bcl-2、Bcl-xl與Bad的解離，從而促進順鉑對肝癌干細胞的凋亡誘導活性。