奶牛NKA1B2基因intron4上C2833T與耐熱指標及產奶量的關聯分析

韓業東，張振梅

（1.遼寧省畜產品安全監察所，遼寧 沈陽 110003；2.沈陽市動物衛生監督所，遼寧 沈陽 110000）

Na+-K+-ATP酶（NKA），是一類廣泛存在于真核生物細胞膜上的跨膜載體蛋白，是細胞內離子轉運和能量代謝的重要系統，直接或間接地參與細胞內外的離子調節，機體的生理活動和體溫調節過程。研究發現，細胞內Na+和K+的平衡主要有NKA來調節，NKA活性的降低可引起細胞的離子跨膜轉運障礙，能量代謝和物質代謝的紊亂。多位學者證實在炎熱的夏季，持續高溫造成的熱應激可導致奶牛直腸溫度、呼吸頻率、紅細胞鉀、產奶量發生明顯的變化。研究發現，荷斯坦牛紅細胞NKA活力與產奶量下降率極顯著負相關。在本研究中，我們對荷斯坦奶牛NKA1B2基因內含子4上的SNP進行群體遺傳學分析，從不同基因型分析對產奶量的影響以及對體溫，鉀離子，紅細胞鈉鉀泵的變化，以其為荷斯坦耐熱奶牛的選育提供理論依據和參考指標。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

從規模化奶牛場中隨機挑選具有完整DHI記錄（乳脂率、乳蛋白率、305天產奶量及體細胞數）的同一胎次中國荷斯坦奶牛836頭。所有生產數據通過Foss 6000乳成分及體細胞聯機分析系統檢測獲得。體溫分階段場內測定，生化指標實驗室測定。靜脈采血(10毫升/頭)，ACD抗凝，-20℃保存。

1.2 NKA1B2的SNP檢測

根據牛NKA1B2基因全序列(NCBI登錄號：NC_007317-2)，使用Primer5.0軟件，設計2對引物(見表1)。以DNA池為模板，按照（PCR反應體系均為25微升，包括10×buffer2.5微升，25毫摩爾/升Mg2＋1.8微升，10毫摩爾/升dNTPs0.5微升，10微摩爾/升上、下游引物各0.8微升，模板DNA 1.0微升，5單位/微升Taq DNA 聚合酶0.5微升，三蒸水17.1微升。PCR擴增條件為：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，退火（退火溫度見表1）30秒，72℃延伸30秒，35個循環， 最后72℃延伸7分鐘）PCR體系進行反應，PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后測序。

1.3 NKA1B2基因分型

用PCR-SSCP來進行基因分型，方法是把6微升PCR產物加入25微升離心管中，然后再加入9微升變性劑（95%甲酰胺，25毫摩爾EDTA，0.025%二甲苯青，0.025%溴酚藍），98℃變性10分鐘，迅速冰浴5分鐘。變性的DNA用10%PAGE電泳（80×73×0.75毫米），1×TBE buffer，穩壓（120伏），4℃，電泳10～14小時，用0.1%硝酸銀進行染色，根據PCR-SSCP電泳結果判斷每一個體的基因型。

1.4 耐熱評定指標的測定

將-20℃的ACD抗凝血5毫升，靜置溶解后于4℃、3000轉/分鐘離心30分鐘，分離血清抽提基因組DNA（酚-氯仿法），然后按1∶2體積加入生理鹽水， 輕輕搖勻，4℃、7000轉/分鐘離心8分鐘，棄上清，重復洗3次，最后制得純凈的紅細胞。用移液槍插入試管底部， 準確吸取0.5毫升紅細胞轉移到加有1毫升滅菌生理鹽水的1.5毫升離心管中，標號冷藏待測紅細胞k+（原子吸光法），剩余的紅細胞用于制備紅細胞膜（低滲溶血法），測定紅細胞NKA活力（無機磷比色法）。

1.5 數據的統計分析

統計中國荷斯坦奶牛的基因頻率和基因型頻率，計算χ2值、多態信息含量(PIC)、有效等位基因數(Ne)和位點的雜合度(H)。在最小二乘法擬合線性模型中用SPSS13.0軟件比較中國荷斯坦奶牛的乳脂率、乳蛋白率、305天產奶量、體細胞評分（SCS）在不同基因型之間的差異。分析中使用固定效應的線性模型是：Yijkil=u+hi+pj+sk+ml+eijkli（其中：Yijkil=耐熱性能觀察值；u=群體均值；hi=基因型的固定效應值；pj=父本的固定效應值；sk=母本的固定效應值；ml=產奶性能效應值；eijkli=隨機殘差效應）。結果以“平均數±標準誤”的形式表示。

2 試驗結果

2.1 擴增產物電泳，測序和分型

PCR擴增經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，都產生了清晰的、能夠準確判斷的目的條帶756bp和173bp，隨機抽取部分樣本進行兩次重復測序，同時發現第4內含子的C2833T突變，通過PCR-SSCP分型，發現3種基因型CC、CT和TT，見圖1。

圖1 NKA1B2基因的C2833T位點特征

2.2 群體遺傳學分析

P C R-S S C P檢測到C2833T位點具有兩個等位基因（C、T），三種基因型（C C、C T、T T），等位基因頻率和基因型頻率、多態信息含量（PIC）、雜合度（H）、有效等位基因數（Ne）、卡方（χ2）見表2。

表1 引物設計

表2 C2833T在荷斯坦牛群體中的遺傳多樣性

表3 NKA1B2基因不同基因型個體的產奶量

表4 NKA1B2基因不同基因型個體的體溫

表5 NKA1B2基因不同基因型個體紅細胞k+

表6 NKA1B2基因不同基因型個體的紅細胞NKA

2.3 NKA1B2不同基因型與產奶量的相關分析

表3分析中國荷斯坦牛NKA1B2基因2833位點的CT基因型個體產奶量在熱應激期顯著低于TT基因型個體，在非熱應激期CT基因型個體產奶量顯著低于CC和TT基因型個體。

2.4 NKA1B2不同基因型與耐熱評定指標的相關分析

由表4可知，中國荷斯坦牛NKA1B2基因2833位點的CT基因型個體體溫在熱應激期極顯著高于CC和TT基因型個體。

由表5可知，中國荷斯坦牛NKA1B2基因2833位點的CT基因型個體紅細胞k+在熱應激期顯著高于TT基因型個體。

由表6可知，中國荷斯坦牛NKA1B2基因2833位點的TT基因型個體紅細胞NKA活力在熱應激期顯著高于CC和TT基因型個體。

3 討論

熱應激期，中國荷斯坦牛體溫升高、紅細胞K+、產奶量和紅細胞NKA活力都降低，這與李建國、穆玉云、史彬林、楊淑晶的研究結果相一致；TT基因型個體在熱應激期表現出體溫較低，紅細胞鉀低，產奶量下降率低，NKA活力下降率低的優良特征，具有很好的耐熱性。許多研究表明NKA與多種疾病有關，一般都有NKA活性的下調，可引起細胞的離子跨膜轉運障礙，能量代謝和物質代謝紊亂。紅細胞NKA是細胞從胞外攝取K+的唯一途徑，NKA活性抑制，導致細胞攝取K+的能力降低；NKA活性降低，將不能利用ADP的磷酸化生成ATP使體內底物氧化釋放的能量以熱的形式散發，導致體溫升高，但NKA在熱應激過程中活性下調導致體溫升高是否遵循ATP的偶聯機制有待研究論證；哺乳動物成熟的紅細胞所需能量幾乎完全依靠葡萄糖酵解而取得，酵解產生的ATP主要用于維持細胞膜上的NKA的運行，如ATP缺乏，則膜內外離子平衡失調，使動物細胞質膜中依賴于離子梯度形式貯存的能量推動的糖和氨基酸的代謝發生紊亂，這與熱應激期產奶量的下降是否關聯有待進一步研究。在生產中奶牛熱應激時，采食量下降，Na+、K+等攝入減少，唾液分泌增加，皮膚汗液蒸發量增加，也導致體溫升高，血液中Na+、K+損失和產奶量的下降。因此，作者認為，奶牛在熱應激的初始階段，通過物理性的調節，改變自身的呼吸頻率，體溫，唾液和汗液的分泌來抵抗外界高溫環境，而持續熱應激時，就需要化學性的調節，改變體內的激素分泌，ATP水解和物質代謝來抵抗持續高溫。在夏季生產中看到奶牛采食減少、站立不動、吐舌流哈、體表隱汗和檢測到體溫升高、產奶量下降、紅細胞K+下降、紅細胞NKA活力下降等各種生理生化指標的顯著變化可以客觀的驗證奶牛處于熱應激。

4 結論

本研究測序發現中國荷斯坦牛NKA1B2基因的第4內含子存在新的SNP位點C2833T，PCR-SSCP分型發現3種基因型CC、CT和TT，都與產奶量及生理生化指標存在顯著相關，且TT基因型個體相對具有優越的產奶量和良好的熱應激抵抗性。因此，NKA1B2基因C2833T可能作為荷斯坦奶牛耐熱性能評定的分子遺傳標記，但仍需加大樣本量和試驗研究論證。