環境脅迫因子對蠟樣芽孢桿菌毒力基因表達和致病性的影響

王 琰，劉金蘭

(天津農學院水產學院/天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384)

魚病的發生是宿主、病原和環境三者相互作用的結果。環境脅迫可以分為急性脅迫和慢性脅迫，指的是魚類所處的生存環境產生急劇變化而對其產生刺激，從而能打破魚類正常的生理功能，對其健康造成不利影響[9]。在魚類養殖過程中，溫度、pH值、亞硝酸鹽濃度等是影響魚體正常生長的重要脅迫因子。由于魚類是水生變溫動物，它的生長發育與水環境溫度密切相關。溫度不僅直接影響正常的生長發育與魚體生理功能，而且間接制約了水體中氨氮和溶解氧等理化因子的含量[10]。pH值作為不可忽視的脅迫因子之一，過高或過低都會對魚體產生影響[11]。亞硝酸鹽濃度過高可以降低魚體血液載氧能力，造成組織缺氧，甚至導致窒息死亡[12-14]。

研究蠟樣芽孢桿菌大多集中在食品領域，在水產上相對較少，關于其毒力基因表達的研究非常缺乏。開展環境脅迫因子對細菌毒力基因表達的研究，將有助于闡明細菌的流行病規律、蠟樣芽孢桿菌感染的發生機理，以及提供有效的生態學防治措施。本試驗將研究溫度、pH值和亞硝酸鹽濃度這3種常見環境脅迫因子的變化對蠟樣芽孢桿菌5種毒力基因表達的影響，同時運用正交試驗研究其對斑馬魚致病性的影響，以期能明確養殖條件變化對蠟樣芽孢桿菌致病性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用Bc分離自有典型臨床出血癥狀的半滑舌鰨，經檢驗含溶血素 BL基因(hblC)、腸毒素 T 基因(bceT)、細胞毒素 K 基因(CytK)、多效調控因子(plcR)、非溶血性腸毒素(nheA)，由天津農學院水產動物病害實驗室保種。斑馬魚購自天津市中環花鳥魚蟲市場，長度為3.0～3.5 cm，均健康無病，經過1周暫養，待試驗魚穩定后，用于試驗。

1.2 培養基

1.2.1 單因素培養基 (1)溫度組(T)。將2216E海水液體培養基調pH值為7.2，不加亞硝酸鹽。(2)pH值組(P)。將2216E海水液體培養基pH值分別調為6.0、7.2 、8.5，不加亞硝酸鹽。(3)亞硝酸鹽濃度組(Y)。在pH值為7.2的2216E海水液體培養基中加入亞硝酸鹽使其濃度為0.75、1.50、3.00 mg/L。

1.2.2 正交試驗設計 采用正交試驗設計方法設計3因素(溫度、pH值、亞硝酸鹽濃度)3水平，因素與水平見表1。在基礎2216E海水液體培養基中按照表2方案進行配制。

表1 環境脅迫因子正交試驗因素水平

表2 環境脅迫因子正交試驗方案

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌培養 在3組(每組3個重復)單因素培養基中，分別加入100 μL保存在-20 ℃的Bc菌株。T組分別在25、30、35 ℃搖床180 r/min培養12 h；P組和Y組在30 ℃搖床180 r/min培養12 h。

在配制好的9組正交試驗培養基中，分別加入100 μL保存在-20 ℃的Bc菌株。按照表2的設計，分別在對應溫度的搖床180 r/min培養12 h。

1.3.2 RNA的制備和反轉錄 將經過“1.3.1”節方法培養的細菌菌液1.0 mL，放入1.5 mL無核酸酶的離心管中離心留沉淀及100 μL上清，充分振蕩懸浮細菌，直至沒有細胞團塊。然后按照飛捷(RNAfast200)RNA提取說明書步驟進行RNA提取。對提取的RNA樣品均進行凝膠電泳成像檢測，檢驗提取的RNA中無基因組DNA污染。

將提取的RNA測濃度之后，按照TIANScript RT Kit試劑盒說明書進行反轉錄。PCR擴增所用引物參照表3。PCR反應體系(20 μL)包括：2×TaqPCR Mix(天根)10 μL，25 μmol的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用滅菌超純水調整終體積至20 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃ 8 min。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果。

表3 Bc毒力基因引物序列及擴增產物長度

1.3.3 Bc 致病性試驗 根據表2的正交試驗方案，進行正交試驗。調試好試驗水體各項指標后，在2216E海水液體培養基培養，調試最終濃度為108CFU/mL的Bc對魚體進行養殖功毒試驗。根據7 d內試驗魚體死亡情況，記錄其死亡率(%)。

2 結果與分析

2.1 單因素對Bc毒力基因表達的影響

2.1.1 溫度對Bc毒力基因表達的影響 從表4和圖1至圖5可以看出，在溫度梯度下，CytK和plcR差異不顯著，其中CytK和plcR35 ℃時基因表達較強；becT在溫度為25 ℃時基因表達顯著高于30、35 ℃，30、35 ℃間差異不明顯；nheA在溫度為30、35 ℃時基因表達顯著高于25 ℃，但30 ℃的基因表達與35 ℃時差異不顯著；hblC在溫度為25、35 ℃時基因表達顯著高于30 ℃，而25、35 ℃基因表達間差異不顯著。

2.1.2 pH值對Bc毒力基因表達的影響 從表5和圖1至圖5可以看出，在pH值梯度下，CytK和nheA基因表達均差異不顯著，其中CytK在pH值為8.5時基因表達較強，nheA

表4 不同溫度值對Bc毒力基因表達的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表5、表6同。

在pH值為7.2時基因表達較強；becT、hblC和plcR均在pH值為8.5時基因表達顯著高于pH值為7.2和6.0，而pH值為7.2、6.0間基因表達差異不顯著。

2.1.3 亞硝酸鹽濃度對Bc毒力基因表達的影響 從表6和圖1至圖5可以看出，CytK在亞硝酸鹽濃度為3.00 mg/L時的基因表達顯著高于0.75、1.50 mg/L，而濃度為0.75、1.50 mg/L 間差異不顯著；hblC、nheA均在濃度為1.50、3.00 mg/L 時基因表達顯著高于0.75 mg/L時，并且均在 3.00 mg/L 時基因表達略高于1.50 mg/L時；becT和plcR均在濃度3.00 mg/L時基因表達顯著高于濃度為1.50、0.75 mg/L 時。

2.2 正交試驗對Bc毒力基因表達的影響

影響CytK基因表達的因素依次為亞硝酸鹽濃度>溫度>pH值，三者之間均無顯著差異(表8)，基因表達最高組是第4組，即溫度25 ℃、pH值8.5、亞硝酸鹽濃度1.50 mg/L(表7)；影響becT基因表達的因素依次為溫度>亞硝酸鹽濃度>pH值，三者之間差異不顯著(表9)，基因表達最高組是第1組，即溫度35 ℃、pH值8.5、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L(表7)；影響hblC基因表達的因素依次為溫度>pH值>亞硝酸鹽濃度，三者間差異不顯著，基因表達最高組是第9組，即溫度25 ℃、pH值6.0、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L(表7)；影響plcR基因表達的因素依次為溫度>亞硝酸鹽濃度>pH值，三者間差異不顯著(表11)，基因表達最高組是第9組，即溫度25 ℃、pH值6.0、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L(表7)；影響nheA基因表達的因素依次為溫度>亞硝酸鹽濃度>pH值，三者間差異不顯著(表12)，基因表達最高組是第9組，即溫度25 ℃、pH值6.0、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L(表7)。第1組至第9組Bc毒力基因表達結果見圖6至圖14。

2.3 環境脅迫因子對Bc致病性的影響

影響Bc致死率的因素為溫度>亞硝酸鹽濃度>pH值，三者之間無顯著差異，其致死率最高組為第9組，即溫度 25 ℃、pH值6.0、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L(表13、表14)。

3 討論與結論

3.1 單因素對Bc毒力基因表達的影響

表5 不同pH值對Bc毒力基因表達的影響

表6 不同亞硝酸鹽值對Bc毒力基因表達的影響

表7 Bc毒力基因表達正交試驗結果

表8 CytK正交試驗結果方差分析

表9 becT正交試驗結果方差分析

表10 hblC正交試驗結果方差分析

表11 plcR正交試驗結果方差分析

表12 nheA正交試驗結果方差分析

為明確環境對Bc毒力基因表達的影響，本試驗選擇了溫度、pH值和亞硝酸鹽濃度3種環境脅迫因子進行研究。研究結果顯示，Bc毒力基因的表達總體上是受溫度、pH值和亞硝酸鹽濃度影響。試驗結果表明，在溫度、pH值和亞硝酸鹽濃度3種環境脅迫因子影響下，CytK與PlcR均在3種因子得最高值時表達高效，原因在于CytK基因的表達是由CytK啟動子序列上的plcR調節因子所控制，同時在CytK的氨基酸末端序列含有1個分泌信號的多肽，這種多肽能調控CytK毒素的分泌[15]。同時hblC也在3種因子的最高值時表達高效，與近年來在廣東順德、中山、惠州出現的中華鱉暴發病癥狀(腹甲有出血斑，頸部充血腫大，豎起身體浮于水面，以7月左右為發病的高峰期)[4]相一致。發病池塘夏季水溫較高，水中可能出現缺氧，造成中華鱉身體浮于水面。becT作為腸毒素基因在溫度25℃時表達高效，與黃顙魚患病時胃、腸道發白，腸內無食，并且該病在每年的9—10月流行現象[7]相一致，而becT在pH值和亞硝酸鹽最高值時表達高效，水體中魚類死亡造成pH值和亞硝酸鹽含量增高，進而加速becT基因表達。溫度和亞硝酸鹽濃度對nheA的影響要大于pH值，非溶血性腸毒素(nhe)的蛋白質成分與hbl區別很大，不具有明顯的溶血性[15]，但和hblC一致是在溫度和亞硝酸鹽最高值時表達高效，共同作用毒力基因表達。

表13 環境脅迫因子對Bc致病性正交試驗結果

表14 環境脅迫因子對Bc致病性正交試驗結果方差分析

3.2 正交試驗對Bc毒力基因表達的影響

環境中同時存在或先后降臨的脅迫因素往往不是一種，而是多種。不同的脅迫因素之間有相互作用[16]。因此正交試驗能反映環境脅迫因子共同作用下對Bc毒力基因表達的影響。運用正交試驗研究環境脅迫因子不同比例條件下的Bc毒力基因表達，從而找到其表達高效時環境脅迫因子的配比。根據試驗結果，CytK基因表達量最高為第4組，即溫度25 ℃、pH值8.5、亞硝酸鹽濃度1.5 mg/L；而becT基因表達量最高為第1組，即溫度35 ℃、pH值8.5、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L；hblC、plcR、nheA基因表達量最高均為第9組，即溫度25 ℃、pH值6.0、亞硝酸鹽0.75 mg/L。在溫度較低時，弱堿和強堿均能使毒力基因表達高效，因此在溫度較低時，要控制水中的pH值來降低基因表達；當溫度較高時，強堿更能使毒力基因表達高效。而水中亞硝酸鹽的含量在0.75、1.5 mg/L 水平時更能使毒力基因表達高效。

3.3 環境脅迫因子對Bc致病性的影響

環境脅迫因子對魚體的各種刺激對魚類具有致死性[17]，毋庸置疑其會嚴重影響水產經濟；即使是亞致死性的脅迫，也足以引起魚類的應激反應。雖說應激反應是機體的一種保護性反應，但由于血液皮質激素水平升高，使機體在對應激原的反應時有可能抑制機體特異性和非特異性的防御能力，并導致對病原的敏感性增高[18]。正交試驗結果表明，影響Bc致死率的因素影響由大到小依次為溫度>亞硝酸鹽>pH值，其中溫度對致病性影響最強烈。低溫會嚴重影響熱帶和亞熱帶生活的水生動物[19]。這印證了在第9組(溫度25℃、pH值6.0、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L)時，斑馬魚的致死率最高。斑馬魚在pH值為6.0時死亡率高，因為低pH值對魚的感官和呼吸器官有毒害作用，使其攝食能力下降、耗氧量升高、生存能力減弱。此外，過低pH值會導致滲透壓調節機制失調，打破血液酸堿平衡，從而阻礙魚體生理生化機制的正常運作[20]。亞硝酸鹽的毒性作用是由于亞硝酸鹽進入血液后，將血紅蛋白分子的Fe2+氧化成為Fe3+，抑制血液的載氧能力，從而造成組織缺氧、神經麻痹甚至窒息死亡[21-22]，加速魚類死亡。本試驗雖然顯示環境脅迫因子對斑馬魚的致死率沒有顯著影響，但是在正交試驗條件下環境脅迫因子對Bc毒力基因表達起支持作用，為預測實際養殖池塘中發病率的大小和其發病的危險程度提供相關參考，以便于早做調節，減少損失。