獼猴桃果肉內生菌株鑒定及其抑菌活性分析

陳幫丹，魏 洪，黃亞勵，馮 麗，李俞亭，王芳勝

(1.貴州醫科大學微生物學教研室/貴州省醫科大學感染與免疫學實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州省六盤水市人民醫院檢驗科，貴州六盤水 553000)

我國植物資源豐富，從植物中分離和提取具活性物質的內生菌可應用于新型活性物質的生產，制造環保、高效的新藥。Ezra等從植物中分離得到具有抑菌活性的內生菌株對細菌、真菌有明顯的抑制作用[1]，這為天然抗菌物質的研究提供了可靠、實用的理論依據[2]。植物內生菌是生活在植物活性組織內較為特殊的微生物，包括潛伏在宿主體內的病原微生物，是植物組織內的正常菌群，也是植物微生物生態系統中的天然組成部分[3]。有研究表明，內生細菌通常不會傷害植物的各種組織器官，而能夠促進植物的生長[4-5]。天然抗菌物質具有抑菌性強、無毒、性能穩定、廣譜高效等優點，已成為食品及醫藥研究的熱點[6]。目前，從多種植物中已分離到內生菌株。程小梅等從獼猴桃枝、莖、葉及腐爛果實中可分離得到內生菌真菌和導致腐爛的細菌[7-8]；王美琴等從番茄內分離得到642株內生菌株，并應用平板法篩選出2株具有抑菌活性的菌株[9]；范曉靜等從銀杏內獲得1株具有抑菌活性的解淀粉芽孢桿菌，并采用對峙法明確其抑菌活性[10]；梁盛年等從柑橘枝葉樣本中分離得到內生細菌55株，經顯微鏡形態觀察初步鑒定這些菌株分屬5個屬，并采用紙片擴散法(K-B法)確定有12株具有抑菌活性[11]；王夢穎等使用平板傾注法從香蕉中獲得具廣譜活性的菌株[12]；Chen等應用形態學、分子生物學從蘭科植物的種子和根中分離鑒定得到植物內生菌[13]；Ziyake等從駱駝刺中分離到20株內生菌，并采用瓊脂擴散法篩選具抑菌活性的菌株[14]；Kumar等從姜黃中分離到對大腸埃希菌有抑菌作用的內生菌[15]。

獼猴桃為獼猴桃科獼猴桃屬多年生落葉植物，果實營養豐富，有“維生素C之王”的美稱，深受消費者喜愛。貴州省修文縣是獼猴桃之鄉，種植面積達15萬hm2，掛果面積約為 3 330 hm2，產量超過4萬t。目前，未見有關新鮮健康獼猴桃果實分離到具抑菌活性菌株的報道。從高產的健康獼猴桃果實中分離鑒定內生菌，研究其抑菌譜和抑菌活性，對獼猴桃天然抗菌物質的開發應用具有重要意義，可為獼猴桃產業深加工發展提供新的方向，也為其產業開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

獼猴桃果實采集于貴州省修文縣三金圣果有限公司獼猴桃園內。大腸埃希氏菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、枯草芽孢桿菌(ATCC6633)、白色念珠菌(ATCC10231)等標準菌株，由貴州醫科大學感染與免疫實驗室提供；大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、肺炎鏈球菌、溶血性葡萄球菌等臨床菌株，由貴州省六盤水市人民醫院檢驗科分離鑒定并保存。Luria-Bertani培養基(LB培養基)，由青島雅各化學試劑有限公司提供；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)，由鼎國生物技術有限公司提供；水解酪蛋白(Mueller-Hinton)培養基(MH培養基)，由杭州濱和微生物試劑有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 獼猴桃果實內生細菌的分離純化 新鮮獼猴桃果實經70%乙醇溶液表面消毒[10]，用接種針挑取果肉分別于PDA培養基、LB培養基上28 ℃培養7 d，觀察菌落生長情況；轉種培養3次以純化菌株，4 ℃保存，備用。

1.2.2 獼猴桃果實內生拮抗菌株的篩選 采用平板對峙法[16]，在直徑為9 cm的PDA平板中央接入鏈格孢菌；距中央2.5 cm處接入1環培養24～48 h的分離純化菌株菌苔，28 ℃ 培養3 d，以不接種菌株處理為對照，測定菌株對鏈格孢菌的抑菌活性。

1.2.3 分離菌株無菌發酵液的制備 在150 mL三角燒瓶中加入30 mL PDA液體培養基，接種內生菌到三角燒瓶中，37 ℃ 180 r/min搖床培養72 h，發酵液4 ℃ 10 000 r/min離心10 min；取上清液，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min；上清液用0.45 μm的水系、微孔濾膜過濾除菌，即得無菌發酵濾液。

1.2.4 分離菌株無菌發酵液平板傾注法培養 將無菌發酵濾液分別稀釋0、2、4、8、16倍制成菌懸液，分別與MH培養基混勻；用0.5號麥氏比濁管分別將標準菌株、臨床菌株配制成孢子濃度為1.5×108CFU/mL的菌液，再用0.9%氯化鈉溶液(生理鹽水)稀釋成孢子濃度為1×105CFU/mL的菌液，接種在混勻的培養基表面，倒置于恒溫箱28 ℃中培養24～48 h，觀察其生長情況[12]。

1.2.5 內生菌菌株的鑒定

1.2.5.1 生理生化特性鑒定[17]將保存的菌株復蘇，接種于血平板培養基上，培養箱中28 ℃培養24 h；挑起單個菌落進行革蘭氏染色，油鏡(100×)下觀察細菌形態；根據革蘭氏染色情況，挑起上面培養的單個菌落，穿刺相應乳酸、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、木糖、七葉苷、鳥氨酸、賴氨酸、精氨酸、硝酸鹽、靛基質、枸櫞酸鹽共13個生化管。

1.2.5.2 掃描電鏡形態觀察 取內生菌1 mL發酵液，8 000 r/min 室溫離心1 min；棄上清，加入2.5%戊二醛，4 ℃冰箱中固定4～8 h，8 000 r/min室溫離心1 min；棄上清，磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)清洗3次，按30%、50%、70%、80%、90%順序梯度脫水，每次加入后靜置15 min，8 000 r/min室溫離心1 min；100%乙醇洗滌2次，用300～600 μL無水乙醇重懸浮，待用；吸取重懸液7～10 μL置于干燥儀內干燥，將干燥好的樣品用雙面膠置于掃描電鏡專用樣品臺上，經離子濺射噴金后在掃描電鏡下觀察菌體形態結構[18]。

1.2.5.3 分子生物學鑒定 細菌菌株DNA的提取參照易潤華等的方法[19]，應用16S rDNA進行PCR擴增；取5 μL擴增產物于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，DNA目的條帶送上海生工生物工程有限公司進行測序，將所得的16S rRNA基因序列用Blast軟件與GenBank數據庫進行相似性比對，采用Mega 5.0軟件N-J法建立系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃果實內生菌的菌落特征

由圖1可見，從獼猴桃果肉內分離出3株植物內生菌M1、M2、M3，經PDA培養基培養，內生菌M1菌落形態為灰色，內生菌M2菌落形態為黃褐色，內生菌M3菌落形態為白色，3株內生菌均表面粗糙，呈絨狀。

2.2 獼猴桃果實內生菌拮抗菌株的篩選

試驗結果(圖2)表明，只接種鏈格孢菌的PDA平板(對照)上，鏈格孢菌占領整個平板，而在對峙接種M3和鏈格孢菌的平板上，鏈格孢菌則沒有越過M3，2種菌之間抑菌帶寬達0.5 cm，說明M3對鏈格孢菌絲生長有明顯抑制作用。

2.3 獼猴桃果實內生菌株抑菌活性試驗

2.3.1 對標準菌株的抑菌效果 由圖3可見，M3無菌發酵濾液原液及其稀釋液對標準菌株大腸埃希氏菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)有較好的抑菌效果，未見這2種菌株的生長。

2.3.2 對臨床菌株的抑菌效果 由圖4、圖5可見，M3菌株無菌發酵液對革蘭氏陰性臨床菌株大腸埃希氏菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌有較好的抑菌效果，上述細菌在不同濃度內生菌發酵液中均未見生長，而對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、肺炎鏈球菌的抑菌效果相對較差，上述細菌在不同濃度的內生菌發酵液中均有不同程度的生長。

2.4 內生菌株M3的鑒定

2.4.1 菌落形態觀察 由圖6、圖7可見，菌株M3在血瓊脂平板上的菌落形態為灰白色、不規則、略凸起、濕潤；革蘭氏染色為陰性，菌體呈球狀、桿狀、球桿狀。

2.4.2 電鏡形態觀察 由圖8可知，M3菌株孢子形態呈桿狀，大小為2.50 μm×0.20 μm左右。

2.4.3 生理生化鑒定 由圖9、表1和檢索伯杰氏細菌鑒定手冊可知，M3菌株的生理生化特性與堿桿菌屬較為接近。

2.4.4 分子生物學和生物信息學鑒定 以M3菌株的基因組DNA為模板，用細菌通用引物進行PCR擴增，得到1條約1 500 bp的DNA片段，用DNA回收試劑盒回收該片段進行測序，序列長度為1 478 b，該序列與GenBank中16S rDNA序列進行比對，M3菌株的16SrDNA與產堿桿菌菌屬的糞腸產堿桿菌同源性高達99.9%。由圖10可見，菌株M3與堿桿菌屬在同一分支上，遺傳進化距離相對最近，這與形態學觀察及生理特性的測定結果一致，可確定M3菌株屬糞產堿桿菌，命名為S1142的16S rDNA序列已在GenBank中注冊，序列號為HM145896.1。

3 結論與討論

本試驗從新鮮獼猴桃果實中分離到1株對革蘭氏陰性臨床菌株有抑菌活性的內生細菌菌株M3，該菌株抗菌譜較廣，抑菌效果較好，通過生理生化反應、革蘭氏染色、電鏡觀察、16S rDNA測序及分子生物學檢測，構建系統發育樹，鑒定M3菌株屬于糞產堿桿菌。糞產堿桿菌一般常見由土壤中分離得到[20]，發現帶有多變異性的質體，攜帶可制造酵素的基因，在生物工程中應用很廣[21]，同時也廣泛應用于制藥工業、廢水處理、去除農藥有毒物質等方面。

隨著抗生素的濫用，臨床耐藥菌的不斷出現向人類發起一輪又一輪的挑戰，以副作用小、安全性高的天然抗生素受到人們的青睞，國內外關于天然抑菌物質的抑菌研究近年來成為熱門。早在10多年前，趙躍等提出探索植物天然抗菌素作為新的治療因子應用于臨床及藥物開發的建議[22]。李楊等從梧桐科蛇婆子屬植物中得到一個獨特的喹啉酮生物堿，初步發現其甲基化衍生物對革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等有抗菌活性[23]。楊澍等從魚腥草中分離出對體外金黃色葡萄球菌和白色念珠菌、對體內金黃色葡萄球菌有明顯抑制菌作用的有效成分魚腥素[24]。本試驗在獼猴桃果實中分離得到M3菌株，在醫學天然抗菌物質的應用將會有重要的研究價值。M3菌株發酵液在平板對峙試驗中對鏈格孢菌有很強的拮抗能力；在平板傾注法中，能明顯抑制標準菌株大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌；在臨床菌株抑制試驗中，革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷柏菌均未見生長，在不同濃度M3菌株發酵液中，革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、 溶血性葡萄球菌、肺炎鏈球菌有不同程度的生長，進一步證實獼猴桃內生菌M3菌株發酵菌液對革蘭氏陰性菌有抑菌作用，對革蘭氏陽性菌無明顯的抑菌作用。

表1 M3菌株生化鑒定結果

注：-表示呈陰性；+表示呈陽性。