草甘膦對中華絨螯蟹成蟹主要免疫指標的影響

洪宇航

(西昌學院動物科學學院，四川西昌 615000)

中華絨鰲蟹(Eriochiersinensis)又稱河蟹、大閘蟹，味道鮮美，營養豐富，是我國特有的淡水養殖蟹類，具有較高的經濟價值。隨著養殖年份的增加，養殖模式更加多元化，其中種養結合的養殖模式已在長江流域、遼河流域大面積推廣[1]。稻田養蟹是一種高效又經濟的立體生態種養技術模式，把水稻種植業和水產養殖業有效地結合起來，發揮各自的積極作用，充分利用整個系統的物質和能量，以獲得水稻、河蟹雙豐收[2]。稻田養蟹技術從開發推廣至今已有30多年歷程，但是一直存在著水稻施藥與河蟹增產的矛盾[3]。草甘膦是美國孟山都公司研發生產的一種高效廣譜滅生性除草劑，由于其水溶性好，效果快，目前在世界各國被普遍使用于農田、果園、養殖水體中的雜草清除，主要通過直接噴灑或地表徑流影響附近水體水生生物[4]。目前，國內外已有較多關于草甘膦對水生生物安全的研究報道，如對于藻類、水蚤、魚類以及蝦蟹類等[5-7]，但其對于甲殼類動物的毒性作用卻少見報道，對我國重要的淡水經濟養殖種類——中華絨螯蟹的影響的報道僅有1例，其主要探究了草甘膦對于中華絨螯蟹幼蟹的毒性[8]，而針對成蟹的研究尚未見報道。

因此，本試驗通過設置不同濃度梯度草甘膦水體，研究其對中華絨螯蟹成蟹主要免疫指標，包括總血細胞密度(THC)、血清中血藍蛋白含量、酚氧化酶(PO)活性、酸性磷酸酶(ACP)活性、堿性磷酸酶(AKP)活性的影響，初步探究草甘膦脅迫下中華絨螯蟹成蟹的免疫應答情況，從而為草甘膦在稻蟹種養及常規養殖池塘除草過程中的使用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗動物中華絨螯蟹成蟹采自江蘇省金壇市水產技術推廣站養殖場。試驗于2016年9月至11月在西昌學院動物科學學院進行。試驗前在循環水養殖系統中暫養7 d以上，24 h氣泵增氧，每日2次投喂人工配合飼料。挑選身體健康、大小均勻的中華絨螯蟹用于試驗，雌雄各占50%，平均質量(107±13.45) g。將中華絨螯蟹隨機放入125 cm×60 cm×60 cm水族缸箱中，每箱10只，箱中加入經曝氣1 d以上的自來水50 L，箱底放置經消毒處理的PVC管作為遮蔽物。光暗周期12 h ∶12 h，試驗期間每日09：00至19：00投喂人工配合飼料，并于投餌后3 h檢查吃食情況，清理糞便和殘餌。試驗期間每日測定水質指標，保證水溫(20±2)℃、pH值 7.2～7.8、溶氧量>5 mg/L、氨態氮含量<0.5 mg/L、亞硝酸鹽含量 <0.15 mg/L。

1.2 濃度梯度設計

草甘膦異丙胺鹽水劑(有效成分41%)，購自浙江省美豐農化有限公司。參考草甘膦在中華絨螯蟹幼蟹毒性試驗中的濃度[8]和其他水生動物毒性試驗中的濃度[5-7]，以及草甘膦在稻田水體中的殘留和消解情況[5]，設置1.90、4.10、6.30、8.50、10.70 mg/L 5個濃度組以及1個0 mg/L空白對照組。每組中華絨螯蟹30只，設置3個平行，分別放置于3個水族箱中。試驗采用48 h半靜水法，每12 h換水1次，并配置相同濃度草甘膦溶液以保證試驗水體濃度不變。分別于3、6、12、24、48 h觀察并記錄中華絨螯蟹的存活情況，每組任意取5只蟹取血淋巴用于免疫指標的檢測。

1.3 分析測定

1.3.1 存活率測定 試驗開始后3、6、12、24、48 h觀察中華絨螯蟹存活情況，以觸碰眼柄無反應，撈出后1 min仍無活動能力判定為死亡。觀察每個觀察點并記錄。

1.3.2 THC測定 每個觀察點取中華絨螯蟹，第5步足基膜處抽取血淋巴100 μL，加入等量抗凝劑(0.1 mol/L葡萄糖、0.14 mol/L氯化鈉、30 mmol/L檸檬酸、10 mmol/L EDTA、pH值=4.6)混勻，立即采用血球計數板進行血細胞計數，每個樣品計數3次，取平均值。

1.3.3 血藍蛋白濃度檢測 每個觀察點取中華絨螯蟹，盡可能多抽取血淋巴至2 mL離心管，立即放置于-4 ℃冰箱4 h以上。11 000 r/min 4 ℃高速冷凍離心30 min，用移液槍小心取上清(血清)于2 mL離心管中，4 ℃保存備用。血藍蛋白含量的測定參考章躍陵等的方法[9]進行改良，用血藍蛋白稀釋液(50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L CaCl2、pH值=8.0)對中華絨螯蟹血清進行100倍稀釋，分光光度計測定334 nm下吸光度，根據Lambert-Beer定律，血藍蛋白濃度：C=D/(EL)(D為吸光度、E為消光系數、L為比色皿厚度)，本試驗采用 1 cm 比色皿，按E334nm=2.3 nm計算血藍蛋白濃度(mg/mL)。

1.3.4 PO活性測定 血清制備方法同“1.3.3”節，PO活性的測定參考Ashida的方法[10]，將50 μL 3 g/LL-dopa、50 μL血清以及50 μL PBS緩沖液(0.1 mol/L、pH值7.0)加入96孔板中，在室溫下混勻孵育20 min，490 nm波長下讀取起始和10 min時的吸光度(D490 nm)，以10 min內每分鐘吸光度增加0.001為1個酶活力單位(U)計算。

1.3.5 ACP活性測定 血清制備方法同“1.3.3”節，ACP活性測定方法遵照ACP活性檢測試劑盒說明書(江蘇南京建成生物科技有限公司)，使用Bio-Rad iMark酶標儀在520 nm波長下測定96孔板各孔吸光度，以每100 mL血清在37 ℃與基質作用30 min產生1 mg酚為1個金氏單位。酶活性最終數據統一換算為國際單位(U/L)。

1.3.6 AKP活性測定 血清制備方法同“1.3.3”節，AKP活性測定方法遵照AKP活性檢測試劑盒說明書(江蘇南京建成生物科技有限公司)，使用Bio-Rad iMark酶標儀在520 nm波長下測定96孔板各孔吸光度，以每100 mL血清在37 ℃與基質作用15 min產生1 mg酚為1個金氏單位。酶活性最終數據統一換算為國際單位(U/L)。

1.4 數據分析

采用SPSS V13.0軟件對試驗數據進行統計分析，用Levene法進行方差齊性檢驗，不滿足齊性方差時對數據進行反正弦或者平方根處理，采用ANOVA對試驗結果進行方差分析，采用Tukey’s法進行多重比較，在GraphPad Prism 5上繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 草甘膦對中華絨螯蟹成蟹存活的影響

試驗期間，除最高濃度10.70 mg/L組外，其他各組均未出現死亡現象。10.70 mg/L組在24 h出現1只死亡，48 h出現3只死亡，48 h死亡率僅為13.3%

2.2 草甘膦對中華絨螯蟹成蟹THC的影響

從圖1可以看出，中華絨螯蟹成蟹THC正常值約為(6.98±0.24)×106個/mL，各組THC隨著攻毒時間延長而上升，且有隨著濃度提高增加幅度加大的趨勢，隨后各組均有所恢復。其中8.50 mg/L組增長幅度最大，并于6 h達到峰值，顯著高于其他各組。10.70 mg/L組THC最初也有所上升，并在12 h達到最大值，但在24 h時出現了下降的情況，并低于0 h正常水平，在48 h顯著低于其他各組。

2.3 草甘膦對中華絨螯蟹血清血藍蛋白含量的影響

從圖2可以看出，隨著接觸時間的延長，不同濃度草甘膦各組血清血藍蛋白濃度均出現先下降再恢復回升的趨勢。且隨著濃度的增加，下降趨勢越明顯。其中8.50 mg/L組下降最多，在12 h達到最低值。在6、12 h，8.50、10.70 mg/L 組血藍蛋白水平均顯著低于其他4組。至48 h 1.90、4.10 mg/L組基本恢復到正常水平，與空白組差異不顯著，而其他3組均顯著低于空白組。

2.4 草甘膦對中華絨螯蟹血清PO活性的影響

從圖3可以看出，各濃度組血清PO活性均有所上升。其中最高濃度10.70 mg/L組上升最為明顯，在3 h時即達到最大值，約為0 h正常水平的3.7倍，顯著高于其他各組；隨后有所下降，但在6 h仍顯著高于其他各組；在12 h時有明顯下降，隨后繼續下降，至48 h仍顯著高于空白組。相比之下，低濃度組變化幅度不大，除12 h外，其他各組在各時間點均同空白組無顯著性差異。

2.5 草甘膦對中華絨螯蟹血清ACP活性的影響

各濃度組血清ACP活性隨著試驗時間延長而下降，其中10.70 mg/L較其他組下降最為明顯，12 h時降至最低值，且在試驗后不同時間段均顯著低于其他各組。8.50 mg/L組下降幅度其次，3 h時并未有明顯下降，至6 h較前3組顯著降低，此后有所恢復。而1.90 mg/L組ACP活性起初雖有減低，但在各時間段與空白組均無顯著差異(圖4)。

2.6 草甘膦對中華絨螯蟹血清AKP活性的影響

各濃度組AKP活性均呈下降趨勢，特別是8.50、10.70 mg/L 組，在3 h檢測時便有明顯下降，顯著低于對照組以及其他3個濃度組；10.70 mg/L組在6 h時降至最低水平，僅有(18.42±2.14) U/L，并在各檢測時間點均顯著低于空白組及低濃度組(圖5)。

3 討論與結論

近年來，草甘膦作為常用廣譜滅生性除草劑，在國內被廣泛使用，包括稻蟹共作的稻田以及空心蓮子草和水葫蘆叢生的養殖池塘等。草甘膦通過直接施加入水以及地表徑流影響附近河流、湖泊，關于其對水生生物的毒性及安全評估有較多報道。傅建煒等研究結果發現，草甘膦對草魚、鰱魚和鯽魚96 h LC50分別為0.251 8、0.258 8、0.259 9 mg/L，均屬于高毒農藥[6]；劉曉偉等研究了草甘膦對多刺裸腹蚤的急性毒性作用，認為草甘膦對多刺裸腹蚤為低毒[11]；朱國念等的研究指出，草甘膦對麥穗魚、蚤狀蚤和斜生柵藻均屬于低毒[5]，而關于草甘膦對蝦蟹類的毒性研究則鮮有報道。史建華等研究了草甘膦對中華絨螯蟹幼蟹急性和慢性毒性，結論為草甘膦對中華絨螯蟹幼蟹毒性屬于低毒，安全濃度為 1.9 mg/L[8]。但其并沒有研究草甘膦對于中華絨螯蟹成蟹的影響。在草甘膦對水體環境安全性研究中，有學者指出，在施用草甘膦后，養殖池塘水體草甘膦殘留量當日為 6.286 mg/L，施藥后1 d下降90%左右，至施藥后6 d降至 0.003 mg/L，消失十分迅速；而在魚塘沉積物中檢測的殘留濃度則較高，1 d后仍高達2.835 mg/L[5]，這對于依賴底質營養的蝦蟹類動物十分不利。目前，已有研究表明，草甘膦對于蝦蟹類，包括日本蟳[7]、克氏原螯蝦[12]、中華絨螯蟹幼蟹[8]等均屬于低毒。因此，草甘膦對于主要經濟蝦蟹類的毒性作用，包括是否能顯著影響其免疫功能，造成應激脅迫而誘發疾病的爆發，成為后續研究的重點。筆者參考草甘膦對于中華絨螯蟹幼蟹的安全濃度以及在水體中當日殘留濃度，設置5個試驗濃度，檢測不同濃度草甘膦對于中華絨螯蟹成蟹主要免疫指標的影響，為后續毒理機制和安全施藥提供理論依據。

血淋巴細胞在甲殼動物機體免疫系統中處于非常關鍵的地位，血細胞總數可以間接反映出動物機體的健康狀態及免疫應激能力，因此經常作為衡量甲殼類動物免疫水平的指標之一[13]。試驗結果表明，不同濃度草甘膦作用下各組中華絨螯蟹THC均有所升高，隨著濃度的增加，升高的趨勢也越明顯。其中8.50 mg/L組上升最明顯，6 h時達到峰值。濃度為10.70 mg/L組在24 h時出現下降。在Cu2+對斑節對蝦毒性研究中，低濃度Cu2+(0.05、0.5 mg/L)下斑節對蝦THC出現了上升，而高濃度(1.5、3.5 mg/L)組則造成THC顯著下降，與本研究結果相似[14]。Gallo等研究表明，對螳螂蝦注射微球菌后，其THC在1 h內顯著上升，并在3 h有明顯回落[15]。而本研究在對健康中華絨螯蟹成蟹注射一定量嗜水氣單孢菌后，注射組較空白組和生理鹽水組THC有明顯上升，在6 h時達到最高，然后逐漸恢復。本研究認為，低濃度草甘膦可以刺激中華絨螯蟹機體的免疫系統，使其THC水平升高以應對應激脅迫。相反高濃度草甘膦則會對免疫功能產生抑制作用，致使THC水平下降。

血藍蛋白分散在機體的血淋巴中，是甲殼類動物的呼吸色素，不僅具有輸氧和免疫防御功能，還與其他理化調節有關，是一種多功能蛋白[9]。本研究表明，不同濃度草甘膦下中華絨螯蟹血藍蛋白含量均出現不同程度減少，且減少程度與草甘膦濃度大致呈正相關。本結果與Yoganandhan等研究中印度對蝦感染WSSV后血藍蛋白含量明顯減少結果[16]一致。此外，樂亞玲研究表明，高濃度銅綠微囊藻可以引起克氏原螯蝦血清血藍蛋白含量在1 h明顯上升，隨后劇烈下降至顯著低于正常水平，并在5 h達到最低值[17]。表明低毒濃度下的草甘膦也能造成中華絨螯蟹血清中血藍蛋白的分解，從而降低了其輸氧和免疫防御的功能。

中華絨螯蟹體液中不具有免疫球蛋白，酚氧化酶(PO)作為其體液免疫主體之一，是抵御外界不利環境的第一道防線，與機體的免疫有直接的關系[18]。結果表明，各濃度草甘膦作用下中華絨螯蟹機體內PO活性都有明顯增強，其中最高濃度組增幅最為明顯，并于3 h達到最高值，隨后下降。這與陸宏達等報道中不同刺激造成機體PO活性增強的結果[19]相似。此外，Dong等在dsRNA攻毒中華絨螯蟹的研究中證實，GFP-dsRNA作用下中華絨螯蟹血淋巴PO活性于6 h時顯著升高并達到峰值[20]；Xian等研究表明，0.5 mg/L Cu2+作用下斑節對蝦血淋巴PO活性會有所上升，同樣在6 h時升至最高[14]。因此，筆者推測高濃度草甘膦可以激活中華絨螯蟹酚氧化酶系統，引起血淋巴中PO活性顯著上升，而作用時間在1～6 h之間，這可能也是多數甲殼動物酚氧化酶系統激活的時間范圍。

ACP、AKP是甲殼動物體內一組重要的水解酶，在甲殼動物免疫應答中起到重要作用。本研究中中華絨螯蟹ACP活性低濃度組出現略微上升，而高濃度組出現下降；AKP則各濃度組均出現下降，且隨著濃度升高愈加明顯。與Zhao等在組織胺對中華絨螯蟹免疫影響研究中的結論[21]相同。不同濃度組織胺注射后，在6 h均引起中華絨螯蟹血清中ACP、AKP活性顯著下降。然而，這一結論同王洪斌等在草甘膦對日本蟳毒性脅迫的研究中所得到的ACP、AKP有明顯上升的結論[7]相悖。這可能是物種差異造成的，具體原因有待進一步分析。

本試驗結果表明，中華絨螯蟹成蟹對于草甘膦的耐受能力遠強于幼蟹，在接近幼蟹48 h半致死濃度的10.70 mg/L濃度下，僅出現13%死亡率。但通過檢測中華絨螯蟹各項免疫指標，筆者發現即使在幼蟹1.90 mg/L安全濃度下，仍對其免疫產生不良影響，特別是AKP活性仍在各時段顯著降低。且隨著藥物濃度升高，對各項免疫指標影響更大。因此，雖然草甘膦在較低濃度下不會直接造成中華絨螯蟹的死亡，但是會對其免疫功能造成影響，尤其是在高溫天氣、水質惡化等情況下增大病害發生的風險，加大了發病概率。此外，在高濃度(達到8.50 mg/L以上)草甘膦作用下，中華絨螯蟹各項免疫指標在48 h仍未恢復至正常水平，表明即使在非致死濃度下，草甘膦可48 h甚至更長時間對中華絨螯蟹的免疫系統造成影響。鑒于此筆者建議在養蟹水體應避免使用草甘膦。