褐牙鲆幼魚耳石上的外源Sr標記試驗

李 爽，李 耕，潘玉洲，張 力，申旭東，李忠紅，鄭文軍，楊文波，袁立來，姜 濤，楊 健

(1.中國水產科學研究院營口增殖實驗站，遼寧營口 115004； 2.中國水產科學研究院，北京 100039；3.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心/院長江中下游漁業生態環境評價與資源養護重點實驗室，江蘇無錫 214081)

耳石是硬骨魚類內耳中的一種硬組織，作為一種生物礦物伴隨著魚類生長的同時，其能以微化學“指紋”或者微結構特征等形式記錄魚類生活史過程中的全部生境履歷信息[1-3]。魚體生長環境的水化學特征的變化導致耳石組成元素發生變化，從而形成耳石上的元素環帶X射線電子探針微區分析技術(EPMA)能夠快速分析固相介質表面的元素種類及含量，具有測試精度高、檢測點密度大、能保持耳石樣品信息完整等優點，為相應元素的檢測分析提供技術保障[4]。由于在不同鹽度水體中魚類耳石上源自生境的鍶(Sr)元素沉積水平差異明顯，因此利用耳石上Sr含量和Sr/Ca的值等指標具有有效推演魚類生活史、重建水體環境變化、識別不同種群的潛力[5-8]。除此之外，利用耳石生長的一些特性(如從受精卵開始耳石即開始形成、一旦形成后不會發生重吸收現象等)，外源Sr標記技術也日益受到重視。然而，我國目前海水魚類耳石外源Sr標記技術尚有待系統研究。

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)別稱牙片、偏口、比目魚，是冷水性、底棲的名貴海產經濟魚類，是北方沿海重要的海水增養殖魚類之一。褐牙鲆個體大、肉質細嫩鮮美、營養豐富、蛋白質含量高、易于消化，是做生魚片的好材料，深受消費者的喜愛，市場十分廣闊，經濟價值很高。牙鲆曾在我國的漁業史上占有重要地位，20世紀七八十年代褐牙鲆的捕獲量為 2 000 t/年。近二三十年來，由于過度捕撈和環境污染造成自然資源大幅度下降，中國牙鲆人工繁育的研究開始于1959年，20世紀70年代才進入苗種生產研究，1992年以后牙鲆人工養殖發展迅速，目前山東、遼寧、河北、江蘇、浙江等地都開展了牙鲆的人工養殖，除了開展網箱養殖和池塘養殖外，正在大力發展大規模的工廠化養殖，并取得了很好的經濟效益和社會效益[9]。增殖放流在牙鲆資源的恢復中起到重要作用，探尋一種高效、穩定、安全的標記方法顯得尤其重要。本研究嘗試通過對褐牙鲆幼魚階段添加外源Sr，并利用EPMA檢測Sr在耳石上的沉積情況，一方面分析外源Sr標記技術在海水魚放流標記工作方面的可行性，另一方面嘗試探討褐牙鲆外源Sr標記的最佳標記濃度。相關研究結果不僅可為拓展海水魚類耳石外源Sr標記技術提供一個重要的實例，同時也可為褐牙鲆放流標記探尋一種更加客觀而有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗設計

2016年4月本研究在中國水產科學研究院營口增殖實驗站望海科研試驗基地進行，試驗魚為實驗站望海試驗基地人工孵化后的仔魚，培育50 d后再開始試驗，配置不同外源SrCl2·6H2O(天津市大茂化學試劑廠)濃度0、8、12、16、20 mg/L 等5組。試驗方案是每組2個平行，共10個養殖水槽。1號組對應0，2號組對應8 mg/L，依次類推至5號組對應20 mg/L。將提前配置不同外源Sr濃度養殖用水放入對應標志的養殖水槽中，并分別放入健康魚苗30尾。浸染20 d，各組換水2次/d，換入水為對應濃度Sr換水換水量為100%，吸底2次/d，投餌2次/d，餌料為新鮮的鹵蟲，20 d后在自然水體中恢復養殖20 d，操作方法與前期相同，恢復養殖20 d后每組隨機取5尾送檢。耳石分析測試在中國水產科學研究院淡水漁業研究中心進行。

1.2 樣品采集、處理與分析

采樣后在解剖鏡下將矢耳石取出，清洗后晾干，置于培養板中備用。耳石先包埋，待樹脂凝固后取出，用AB膠將其粘貼于載玻片上，使用500目砂輪和1 200目砂紙打磨耳石至核心即將暴露后，使用磨拋機裝備機拋光，至耳石表面無明顯劃痕；樣品放入Milli-Q水中超聲清洗5 min后，自然條件下晾干24 h；完全干燥后，使用真空鍍膜機蒸鍍碳膜。

該研究利用電子微探針分析儀進行定量線分析和面分布分析。參考Yang等的方法[10-11]，從耳石核心沿耳石最長徑至邊緣連續測定Sr、Ca含量。

數據處理利用Excel 2007軟件進行線分布分析中的平均值和倍數計算以及Sr/Ca的值變化作圖。耳石中的鍶含量遠小于鈣含量，按慣例Sr/Ca經過標準化的比值，即(Sr/Ca)×103[11]。

1.3 儀器和設備

磨拋機(LaboPol-35，丹麥Struers公司)；真空鍍膜機(JEE-420，日本電子株式會社)；電子微探針分析儀(JXA-8100型EPMA，日本電子株式會社)。

1.4 數據處理

利用Excel 2007軟件進行線分布分析中的平均值和倍數計算以及Sr/Ca值變化作圖，采用SPSS 17.0軟件進行不同階段及與對照組的Sr/Ca值差異顯著性分析，顯著性水平設定為0.05。耳石中的鍶含量遠小于鈣含量，按慣例Sr/Ca經過標準化的比值，即(Sr/Ca)×103[11]。

2 結果與分析

2.1 外源Sr在褐牙鲆耳石上線分析的Sr/Ca值

由圖1和表1可知，空白組即0 mg/L組試驗魚的耳石 Sr/Ca 的值變化不明顯，而8～20 mg/L組試驗魚的耳石 Sr/Ca 的值變化十分明顯，根據圖2不同色區的分布可大致將試驗魚的生長分為3個色區階段。8 mg/L組第一階段的色區為從耳石核心沿矢狀邊緣方向的0～440 μm范圍，Sr/Ca的值與空白組基本一致；第二階段的色區為從耳石核心沿矢狀邊緣方向的440～870 μm范圍，Sr/Ca的值基本達到最高；第三階段的色區從耳石核心沿矢狀邊緣方向的870 μm至耳石最長軸邊緣，其Sr/Ca的值逐漸降低并逐漸趨向第一階段的Sr/Ca的值。12 mg/L組第一階段的色區平均為0～350 μm 范圍，Sr/Ca的值與空白組基本一致；第二階段的色區平均在350～670 μm范圍，Sr/Ca的值基本達到最高；第三階段的色區平均為670 μm至耳石最長軸邊緣，Sr/Ca的值逐漸降低并逐漸趨向第一階段的Sr/Ca的值。16 mg/L組第一階段的色區平均為0～390 μm范圍，Sr/Ca的值與空白組基本一致；第二階段的色區平均為390～670 μm范圍，Sr/Ca的值基本達到最高；第三階段的色區平均為670 μm至耳石最長軸邊緣，Sr/Ca的值逐漸降低并逐漸趨向第一階段的色區。20 mg/L組平均第一階段的色區平均為0～350 μm范圍，Sr/Ca 的值與空白組基本一致；第二階段的色區平均為350～720 μm范圍，Sr/Ca的值基本達到最高；第三階段色區平均為720 μm至耳石最長軸邊緣，Sr/Ca的值逐漸降低并逐漸趨向第一階段的Sr/Ca的值。

不同浸染濃度Sr/Ca的值微化學變化詳細信息見表1，經外源Sr2+干擾后，可將耳石Sr/Ca分為明顯的3個階段。其中，第一階段的Sr/Ca均值與對照均無顯著差異，處理組第二階段的Sr/Ca均值、峰值均顯著高于相應的第一階段(P<0.01)，而比值變動不大的第一階段與第三階段沒有顯著性差異，通過組間比較可以發現16、20 mg/L的Sr峰比較接近，幾乎無差異，故利用人工標記時，可適當選擇低濃度來降低標記成本。

2.2 外源Sr2+在褐牙鲆耳石上的面分布

由圖2所示，褐牙鲆在不同濃度的Sr2+水體中浸染20 d，再恢復到自然水體中再養殖20 d，在耳石上能形成極為明顯的紅色“高鍶環帶”，對照組無變化。同時，“高鍶環帶”明顯隨著外源水體濃度升高和時間的推移而“變寬”并且恢復至正常水體后，鍶環帶緩慢從紅色經黃色向綠色轉變，Sr/Ca的值逐漸降低。表明外源8～20 mg/L濃度的SrCl2·6H2O均能在牙鲆耳石上大量沉積，且鍶環帶顏色與外源鍶濃度呈正相關，在浸染結束后仍能持續向耳石上沉積一段時間，并可恢復至初始水平。

表1 褐牙鲆耳石中鍶鈣含量比值的變化

3 討論與結論

EPMA作為一種有效測定固相微區元素成分的技術，在材料科學、礦物學等領域應用廣泛[11-13]。近年來，隨著對魚類耳石的生態學意義的不斷研究，耳石微化學與魚類生活史信息間的關系得以論證。因此，EPMA分析技術也被引入到了魚類生態學研究中，并憑借交叉學科的優勢使其在海洋[5]、河口[11]、洄游性[10]魚類的生境履歷反演、產卵場群體的識別[14-15]以及淡水魚類[16-17]和洄游性魚類[18]增殖放流標記等方面取得了許多突破性的成果。

通常情況下，魚類耳石中鍶、鈣含量的比值與水體鹽度具有正相關性[19]，借此可以通過分析耳石上Sr/Ca的值來研究魚體的生活水環境鹽度，進而反演其生境履歷信息，討論其時空分布動態以及群體組成情況等。因此，通過人為控制魚類的生活水體中的Sr濃度也必然會在耳石上產生印記，這也得到了本研究結果的證實。在20 d浸染試驗后，耳石上Sr濃度高峰一直持續到接近邊緣，再將其恢復到正常水體養殖20 d后能回到正常水平。從浸染開始時到Sr在褐牙鲆耳石上沉積有延時過程，在含有不同濃度的Sr2+水體中侵染20 d，恢復到正常水體中養殖20 d，而Sr濃度峰區卻持續了20 d以上，在正常水體中養殖時，Sr濃度峰區依舊存在，仍能持續向耳石上沉積一段時間。表明Sr元素從水體到耳石的沉積過程是循序漸進的。姜濤等分析刀鱭(Coilianasus)在快速向淡水洄游后耳石Sr/Ca的值也并不能很快下降至淡水水平[17]。在整個試驗進程中，試驗魚都能保持正常生長、攝食，未產生明顯的應激反應。王臣等在大麻哈魚耳石Sr標記工作的結果顯示，即使在50～400 mg/L這樣含量極高的外源Sr條件下，試驗魚依舊未產生明顯的應激反應或毒性反應，并且之后耳石上的Sr含量能恢復到正常水平[18]，說明其急性毒性風險也較小。而Sr本身亦作為生物的必需元素[17]，由此可見本研究所用0～20 mg/L外源Sr(SrCl2·6H2O)進行褐牙鲆耳石標記工作應該是安全、可行的。

外源Sr在褐牙鲆耳石上沉積的特點能很好地吻合對魚類放流標志的要求，使人工控制外源Sr在耳石上做明顯的“鍶元素標記”成為可能。該標記方法與其他內源性標記方法相比操作簡便，利用精密的EPMA技術檢測準確，從Sr/Ca高峰的出現而言是很穩定的，應該是我國牙鲆放流標志的新方向。值得注意的是，為今后更好地于褐牙鲆增殖放流標記工作中利用該技術，如何篩選所需標記用Sr的最佳劑量、最佳浸染時間，以及如何去評估Sr富集對于牙鲆水產品安全是否會產生影響等很多問題還需要在下一步的研究中得到有針對性的探討。