分散固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中甲基睪酮的殘留量

楊 霄，索紋紋，洪 波，李小玲，曾春芳，黃向榮，3

[1.湖南省水產科學研究所，湖南長沙 410153； 2.農業部漁業產品質量監督檢驗測試中心(長沙)，湖南長沙 410153；3.水產高效健康生產湖南省協同創新中心，湖南常德 415000]

甲基睪酮(methyhestosterone，簡稱MET)，別稱甲睪酮、甲基睪丸酮、甲基睪丸素，是一種人工合成的雄性激素，具有雄性和蛋白同化雙重作用，應用于水產養殖可以提高產量和控制性別[1-2]。甲基睪酮在動物體內代謝緩慢，極小的殘留量都會對人體造成巨大的潛在危害，因此，多數國家已經禁止在動物養殖中使用此種激素，并要求動物源食品中不得檢出該激素。2001年我國農業部實施的行業標準NY 5070—2001《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》中，將甲基睪酮列為禁用藥物。2003年農業部發布的235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規定甲基睪酮為禁用獸藥。

目前，甲基睪酮的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3]、高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[4]以及酶聯免疫法(ELISA)[5]等。HPLC前處理步驟較繁瑣，分析時間長；ELISA容易出現樣品假陽性，定量不準確，較適用于樣品初篩；HPLC-MS/MS前處理較簡單，靈敏度和特異性高，可用于甲基睪酮的準確定量。水產品中甲基睪酮的前處理方法多為傳統的固相萃取[6-7]、超聲提取-乙酸乙酯反萃取[8]、超聲提取-乙醚反萃取[9]、磁力攪拌-液液分配[10]等，這些方法操作步驟較多，耗時長，不利于大批量樣品的快速測定。分散固相萃取(Dispersive-SPE)凈化法(QuEChERS)，是由美國的Lehotay和德國的Anastassiadas于2003年提出的一種快速、簡單、便宜、有效、可靠和安全的樣品前處理技術，該技術直接將吸附劑粉末加入提取液中進行凈化，其操作簡便快速，取樣量少，廉價安全，適合批量樣品的快速分析檢測。本試驗采用QuEChERS方法和HPLC-MS/MS技術，擬建立一種高效、快速的水產品中甲基睪酮殘留量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

本試驗所用中華鱉、羅非魚、凡納濱對蝦均購自長沙市水渡河農產品大市場。

TSQ Quantum Access液相色譜-串聯質譜聯用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；FA25均質器(德國Fluko公司)；精密電子天平(Mettler Toledo公司)；高速冷凍離心機(日本日立公司)；漩渦振蕩器(美國Fisher公司)。

甲基睪酮標準溶液：精確稱取甲基睪丸酮標準品(純度≥98%，德國Dr. Ehrenstorfer公司)5.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，配成質量濃度為100 μg/mL的標準儲備溶液，于-18 ℃保存，臨用時稀釋；甲酸(LC-MS級，美國Sigma公司)；乙腈(HPLC級，德國Merck公司)；N-丙基乙二胺(N-propylethane-1,2-diamine，簡稱PSA，百靈威科技有限公司)；C18吸附劑(70～230目，上海安譜科學儀器有限公司)；無水硫酸鎂(MgSO4，分析純，鄭州益康化工產品有限公司)；試驗用水為超純水。

1.2 儀器分析條件

1.2.1 色譜條件 Atlantis C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.0 μm)；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL；流速為300 μL/min；流動相：甲醇+0.1%甲酸水溶液(體積比=70 ∶30)。

1.2.2 質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI)，正離子方式檢測；噴霧電壓為4 000 V；掃描方式為選擇反應監測(SRM)；毛細管溫度為350 ℃；蒸發溫度為300 ℃；鞘氣壓力為40(arbitrary unit)，輔助氣壓力為10(arbitrary unit)，碰撞氣壓力為199.983 mPa(表1)。

表1 甲基睪酮質譜采集參數

注：“*”標記的為定量離子。

1.3 樣品前處理

水產品取可食肌肉部分，按照SC/T 3016—2004《水產品抽樣方法》的規定處理后置于-18 ℃密封保存。使用前先解凍。

1.3.1 樣品提取 準確稱取(5±0.02) g處理后的樣品于 50 mL 離心管中，加入10 mL乙腈，同時加入3.0 g無水硫酸鎂，渦旋振蕩提取1 min，6 000 r/min離心5 min，取上清液于雞心瓶中。向下層殘渣中加入10 mL乙腈重復提取1次，合并2次的上清液于雞心瓶中。于40 ℃旋轉蒸發至近干。

1.3.2 樣品凈化 在雞心瓶中加入2 mL流動相充分溶解殘渣，取1 mL復溶液轉入裝有50 mg PSA、150 mg C18吸附劑的5 mL離心管中，充分漩渦振蕩2 min，10 000 r/min 離心5 min后，取上清液過0.22 μm聚四氟乙烯膜后上機測定。

1.4 校準曲線的繪制

將空白樣品按照“1.3”節方法處理后，取適量空白上清液加入不同量的甲基睪酮標準儲備液，配制成1、5、10、50、100、200 ng/mL的基質空白標準溶液，混勻后進樣。以待測物提取離子流色譜圖的峰面積為縱坐標、相應待測物質量濃度為橫坐標進行回歸運算，求得直線回歸方程。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的優化

2.1.1 樣品提取溶劑的選擇 本試驗比較了甲醇、乙腈、乙醚、乙酸乙酯4種溶劑的提取效果。結果表明，以上4種溶劑對甲基睪酮的提取效率均較高，達到75%以上。甲醇能溶解大多數極性物質，乙酸乙酯提取的親脂性化合物較多，二者共萃取雜質多，易造成基質干擾，而乙腈、乙醚樣品提取液較清澈，基質干擾較小，且目標物周圍無明顯的雜質干擾峰，但乙醚易揮發、毒性大，對試驗操作者影響大，故本試驗選擇毒性較小、揮發性低的乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 無機鹽用量的選擇 水產品中含有不同量的水分，且水分與乙腈互溶，在目標化合物被乙腈提取的過程中部分水相分配到乙腈提取層，影響試驗結果和下一步分離操作。因而需要加入合適的無機鹽去除有機相的水分。本試驗根據Schenck等的報道[11]，選用無水MgSO4作為除水劑。試驗比較了不同量的無水MgSO4對除水效果的影響，結果發現，當無水MgSO4用量為3 g時可以有效除去水分，回收率較高；當無水MgSO4用量少于2 g時，不能完全除去有機相的水分，造成樣品濃度稀釋，導致回收率降低；當無水MgSO4用量為5 g時，過量的無機鹽將目標化合物部分包埋，使待測物未完全進入乙腈提取相，從而降低了回收率(圖1)。因此，本試驗選用 3 g 無水MgSO4作為除水劑。

2.1.3 分散固相萃取條件的優化 樣品經過乙腈沉淀蛋白質后已經去除了大部分的干擾物，但仍可能存在少量的色素、脂肪等雜質，為了提高凈化效率和減少待測物的損失，本試驗采用分散固相萃取的凈化手段。PSA作為凈化吸附劑可以除去樣品基質中的少量極性色素、有機酸、酚類和糖類，C18吸附劑可以除去一些強疏水性干擾物(如脂肪)。由于魚蝦樣品中含有大量的蛋白質、脂肪以及一些色素等干擾物質，所以本試驗采用PSA和C18作為吸附劑進行分散固相萃取凈化。本試驗在5份1 mL空白魚肉提取液中加入標準溶液后，再分別加入不同比例的PSA和C18，得到甲基睪酮的加標回收率。從圖2可以看出，當PSA、C18質量比=100 mg/50 mg時，甲基睪酮的回收率最低，表明PSA對甲基睪酮有一定程度的吸附作用，因此可以適當降低PSA的比例。當PSA、C18質量比=50 mg/150 mg時，甲基睪酮的空白魚肉提取液較清澈，甲基睪酮回收率在85%以上，說明該比例的PSA和C18對目標物的吸附少且可以很好地吸附脂肪、色素等雜質，樣品提取液凈化效果好。當C18的使用比例繼續增加時，無明顯效果，且隨著吸附劑的增加，上清液的量逐漸減少，不方便移取，因此，本試驗選取PSA、C18質量比=50 mg/100 mg作為分散固相萃取吸附劑的用量。

2.2 流動相的選擇

流動相的組成影響目標化合物的峰型、保留時間及質譜的離子化效率[6]。液質聯用的流動相組成為甲醇-水體系和乙腈-水體系。本試驗選用甲醇和乙腈作為有機相，水、0.1% 甲酸水溶液、2 mmol/L乙酸銨水溶液、2 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)作為水相，進行不同組合。結果表明，以甲醇和0.1%甲酸水溶液(體積比為7 ∶3)作為流動相組成時目標化合物的響應強度最大，峰型最尖銳，且目標化合物周圍無明顯雜質峰干擾。

2.3 質譜條件的優化

采用注射泵進樣的方式，以5 μL/min的流速，將 500 ng/mL 甲基睪酮標準溶液注入離子源中，在正離子模式下對甲基睪酮進行一級質譜全掃描，得到分子離子，然后以分子離子為母離子對其子離子進行全掃描，以SRM模式進行檢測。在此基礎上對碰撞能等離子源參數進行優化，使選定的母離子和子離子組成的特征離子的豐度比例最佳。最終確定“1.2.2”節所述的質譜條件。

2.4 基質效應的消除

在液相色譜-質譜分析中，基質效應是客觀存在的。基質效應影響測定結果的精密度和準確度。為了消除(或補償)基質效應給分析結果帶來的偏差，通常采用同位素內標，稀釋樣品溶液，配制空白基質標準溶液以及優化色譜-質譜條件等方法。本試驗采用優化色譜-質譜條件和配制空白基質標準溶液來消除基質效應對檢測結果的影響。

2.5 線性范圍與檢出限

在選定的色譜分離條件和質譜測定參數下，將6個濃度系列的甲基睪酮空白基質標準溶液上機測定，結果表明，在 1～200 ng/mL的質量濃度范圍內，甲基睪酮的色譜峰面積與質量濃度呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=473 540x-132 48，相關系數為0.999 8。50 ng/mL甲基睪酮空白基質標準溶液SRM色譜結果如圖3所示。采用空白樣品添加低濃度的標準品，按“1.3”節方法進行前處理后上機測定，根據特征離子色譜峰的信噪比(S/N值)等于3為檢出限，S/N值等于10為定量限，得到甲基睪酮的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為 1.0 μg/kg。

2.6 準確度與精密度

根據水產品各物種間肌肉成分的差異，如蝦肉中的色素含量較高，中華鱉肌肉中脂肪含量較高等，選取羅非魚、中華鱉以及凡納濱對蝦3類水產品的肌肉組織進行加標回收率試驗。各個品種空白樣品的添加標準物質的濃度為1、10、50 μg/kg，每個濃度水平作平行樣品5個，計算回收率和相對標準偏差，結果見表2。4種樣品的加標回收率為82.4%～96.3%，相對標準偏差為3.21%～6.98%，表明該方法的準確度高，重復性好，符合藥物殘留檢測方法的要求。

2.7 實際樣品測定

將建立的方法用于30份市售水產品(10份草魚，10份羅非魚，5份凡納濱對蝦，5份中華鱉)的檢測，結果發現這30份市售水產品中均未檢出甲基睪酮，說明上述市售水產品中未違規添加甲基睪酮。

表2 加標回收率及精密度試驗結果

3 結論

本研究建立了分散固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定水產品中甲基睪酮殘留量的方法。采用分散固相萃取技術，有機試劑用量少，樣品前處理簡單，易于操作；采用高效液相色譜-串聯質譜檢測，顯著縮短了色譜分析時間，提高了靈敏度。該方法具有簡單、快速、高效、環保的特點，適合當前水產品中甲基睪酮殘留量快速檢測的要求。