中國蜂膠水提物抗腫瘤活性功效成分研究

王月華，王變變，尹旭升，付崇羅，玄紅專

(1.聊城大學生命科學學院，山東聊城 252059； 2.山東省蜂業與蜂產品質量檢驗所，山東泰安 271000)

蜂膠是西方蜜蜂采集植物樹脂并混入唾液腺分泌物后經加工咀嚼而成的一種樹脂狀物質。蜂膠作為一種重要的蜂產品，已有研究表明其具有豐富而獨特的生物活性物質，具有抗細菌、抗病毒、抗炎癥、抗腫瘤、抗真菌等作用[1-5]。目前，從蜂膠中鑒定出的化學組分多達20多類、300多種，主要包括黃酮類、酚酸類、萜烯酸、類固醇類、氨基酸類[6-8]等物質。蜂膠易溶于有機溶劑，目前對中國蜂膠乙醇提取物(ethanol extract of Chinese propolis，簡稱EECP)的研究比較深入，對中國蜂膠水提物(Chinese propolis water extract，簡稱CPWE)的研究較少。中國蜂膠水提物不僅可以避免有機溶劑對動物產生的有害作用[9]，而且有研究發現，中國蜂膠水提物有較好的生物活性，具有非常好的應用價值，正越來越來得到人們的重視[10]。

本研究使用的中國蜂膠水提物是通過制備高效液相色譜(preparative high performance liquid chromatography，簡稱PHPLC)和大孔吸附樹脂(macroprous adsorption resin，簡稱MAR)的方法，分離純化出11種化學成分(咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素、咖啡酸芐酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素)[11]。通過磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，簡稱SRB)法檢測CPWE及其分離純化的11種化學成分對神經膠質瘤細胞(U87和U172)的影響，以期發現蜂膠水提物的抗腫瘤功效成分，為蜂膠水提物的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中國蜂膠產自山東省，膠源植物主要為楊樹；巴西綠膠取自巴西Minas Gerais州，主要植物來源為酒神菊屬。主要試劑有DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；胰酶、磺酰羅丹明B(美國Sigma公司)；細胞培養皿、96孔板(美國Falcon公司)；三羥甲基氨基甲烷[Tris，生工生物工程(上海)股份有限公司]。其他試劑均為分析純。

中國蜂膠水提物和中國蜂膠乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract of Chinese propolis，簡稱EAEP)從中國蜂膠中分離、提純，并經紫外光譜(ultraviolet-visible spectrum，簡稱UV)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，簡稱NMR)鑒定，純度為98%以上[11]。U87和U172細胞由本試驗所在實驗室保存。

1.2 主要儀器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培養箱，力康生物醫療科技控股有限公司；TE2000S倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；MK3酶標儀，芬蘭雷勃公司；AR2140電子分析天平，美國奧豪斯公司；Milli-Q Synthesis超純水系統，美國密理博公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蜂膠中主要組分的制備 (1)提取。依次以水、乙酸乙酯為溶劑對蜂膠中的主要化學成分進行提取，其中水提取物中富含酚酸及其酯，乙酸乙酯提取物中富含黃酮。

(2)粗分離。利用各種色譜技術對蜂膠提取物進行粗分離，水提取物和乙酸乙酯提取物可以分別使用大孔吸附樹脂及聚酰胺實現粗分離。通過對試驗參數(如樹脂的類型、上樣量、流動相的組成、流速等)進行優化，建立最佳試驗方案。

(3)進一步分離與純化。利用各種色譜技術(超臨界流體色譜、制備型高效液相色譜)對蜂膠中多酚類物質的制備型分離純化方法進行研究，對試驗參數(如固定相的種類、流動相的組成、流速、溫度、壓力、上樣量等)進行優化，建立綠色環保、高效快速的分離純化方法。

(4)結構鑒定。利用X射線單晶衍射、核磁共振、高效液相色譜-質譜聯用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，簡稱HPLC-MS)、紅外光譜(infra-red spectrum，簡稱IR)、紫外光譜等多種鑒定手段對分離得到的化合物進行結構鑒定，以闡明蜂膠中的主要化學組成。蜂膠主要成分的色譜結果見圖1。

1.3.2 細胞的培養 U87和U172細胞培養在添加10%胎牛血清的DMEM培養基中。孵育在含有5% CO2、37 ℃、飽和濕度CO2培養箱中。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.3 細胞存活率的測定 將處于對數生長期的細胞按 4 000個/孔 種植到96孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下孵育，待腫瘤細胞長到60%以上，除正常組外，將所有處理組分別經不同濃度的中國蜂膠乙醇提取物、巴西綠膠乙醇提取物、中國蜂膠水提取物、中國蜂膠乙酸乙酯提取物(25、50、100 mg/L)及中國蜂膠水提取物分離純化的11種化學成分(40、80、160 μmol/L)分別處理24、48 h后，棄細胞培養液，用10%三氯乙酸于4 ℃固定1 h，然后用SRB染色10 min，晾干，用100 mmol/L Tris堿溶解，在492 nm處測吸光度。細胞存活率計算公式如下：

細胞存活率=[D492 nm(處理)/D492 nm(對照)]×100%。

1.4 數據統計

2 結果與分析

2.1 不同濃度中國蜂膠水提物中4種酸類化學成分對U87和U172細胞存活率的影響

由圖2可以看出，不同濃度的中國蜂膠水提物中4種酸類化學成分對U87和U172細胞均沒有細胞毒性。

2.2 不同濃度的中國蜂膠水提物中5種黃酮類化學成分對U87和U172細胞存活率的影響

由圖3可以看出，不同濃度的中國蜂膠水提物中5種黃酮類化學成分對U87和U172的細胞活性不同。芹菜素對U87和U172細胞的抑制效果最強，48 h時160 μmol/L芹菜素抑制率均達到55%以上，短葉松素抑制效果最弱，48 h時160 μmol/L芹菜素抑制率僅為9.4%左右。

2.3 不同濃度的中國蜂膠水提物中2種酯類化學成分對U87和U172細胞存活率的影響

由圖4可以看出，不同濃度的中國蜂膠水提物中2種酯類化學成分對U87和U172的細胞活性不同。咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethylester，簡稱CAPE)對細胞的抑制效果更強，48 h時160 μmol/L對U172細胞的抑制率達到79.3%。

2.4 不同濃度的中國蜂膠水提物、乙醇提取物與乙酸乙酯提取物，巴西蜂膠乙醇提取物(EEBP)對U172細胞存活率的影響

由圖5可以看出，在不同濃度的CPWE處理下，EEBP和EECP對U87和U172的細胞活性不同。EEBP對U87和U172細胞基本沒有細胞毒性。中國蜂膠乙酸乙酯提取物和乙醇提取物只有當濃度高于50 mg/L時，才顯著抑制U87和U172細胞增殖，并且具有明顯的時間依賴性。

3 討論

蜂膠是西方蜜蜂采集植物樹脂加工而成的一種黏稠物質，具有多種藥理學活性，長期在民間得以應用。但是目前蜂膠應用中最大的困難就是藥效不穩定、藥效物質基礎不明確。本試驗通過對蜂膠水提物中11種組分的抗腫瘤活性研究發現，蜂膠中發揮抗腫瘤活性的物質基礎主要為咖啡酸苯乙酯和一系列由黃酮類化合物構成的活性成分群，蜂膠中的有機酸類化合物抗腫瘤效果相對較弱，而蜂膠中具體發揮生物活性作用的活性成分群需要進一步發掘、研究。

不同提取方法會影響蜂膠的抗腫瘤功效，蜂膠在水中溶解度較低，因而蜂膠水提物的抗腫瘤功效較弱；蜂膠易溶于有機溶劑，因而蜂膠乙醇提取物和乙酸乙酯提取物均具有較好的抗腫瘤功效。

不同地區蜂膠植物來源不同，決定了蜂膠的化學成分不同，中國楊樹型蜂膠主要成分為酚酸類和黃酮類化合物，而巴西蜂膠主要為香豆酸類，由于化學組分不同，中國蜂膠乙醇提取物和巴西蜂膠乙醇提取物抗腫瘤功效不同，巴西蜂膠抗腫瘤功效較弱。