活血解毒方對糖尿病大鼠視網膜組織中Notch信號通路的影響

邢 瑋，王政霖，王宏亮，呂甜甜，吳 晏，王 偉，韓 靜

（北京中醫藥大學，北京 100029）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是當今全球成人眼盲的主要發病因素之一，為糖尿病晚期眼部最常見的并發癥，主要為血管病變[1]。因此，在治療糖尿病過程中，DR 不容忽視。 糖尿病視網膜病變的發生發展與多種信號通路失常有關。近年來，Notch 信號通路在糖尿病腎病的研究中得到了重視，但其在 DR 中的作用機制尚未明確。Notch信號通路是一條進化上十分保守的信號轉導通路，介導細胞之間的直接接觸，能夠在細胞增殖、分化、凋亡等過程中發揮調控作用。Notch1 為 Notch信號通路中的受體，Delta 樣配體 4（Dll4）是 Notch1 的配體，Hes1 是 Notch信號通路中極其重要的靶基因。Notch 信號通路中的配體和其受體相互結合，是誘導 Notch 受體構象發生改變的原因，由 γ -分泌酶介導，釋放出來 Notch 胞內域（Notch intracellular domain，NICD），其作為 Notch受體活化的形式，在其進入到細胞核后，激活下游的基因 Hes，幫助細胞轉歸，誘導其分化[2]。因此檢測Notch1、Dll4 和 Hes1 的表達水平可以反應 Notch 信號通路的變化。DR在中醫范疇屬“消渴目病”，發病過程復雜[3]。活血解毒方為臨床經驗方，主要由三七、鬼箭羽和黃連等組成。經前期實驗得出，活血解毒方可降低糖化血紅蛋白[4]，改善視網膜中央動脈血流狀況，降低視網膜血管密度，減少內皮細胞與周細胞的比例[5]，但是其藥理機制尚未闡明。本實驗通過建立糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病及活血解毒方對視網膜組織中Notch信號通路產生的作用，探尋糖尿病視網膜病變發展中 Notch 產生的意義，同時揭示活血解毒方對于防治DR的藥理機制。

1　實驗材料

1.1動物 SPF級的雄性SD大鼠共18只，周齡為7周，體質量165～200 g,購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號編號為SCXK（京）2012-0001。飼養在北京中醫藥大學和平街校區實驗動物中心，實驗室相對濕度保持在 50%～70%，室內溫度保持在20～25 ℃，換氣次數10～15次/h，維持12 h/12 h光照黑夜，適應性喂養為期1周。

1.2藥物 鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ，S0130，Sigma公司產品，美國），溶解在檸檬酸鈉溶液中（0.1 mmol/L，pH 4.2～4.5），在冰盒中現用現配；活血解毒方由北京中醫藥大學中藥學院提供。

1.3實驗儀器 BCA蛋白定量試劑盒（Prod#23228，Thermo公司產品，美國），蛋白垂直電泳和轉膜系統、凝膠圖像分析系統（BIO RAD公司產品，美國），增強型化學發光檢測試劑盒（RPN2232，GE Healthcare公司產品，美國），熒光倒置顯微鏡（奧林巴斯株式會社產品，日本），Hes1多克隆抗體（ab71559）、Notch1多克隆抗體（ab52301）及Dll4多克隆抗體（ab183532）購自英國Abcam公司。

2　實驗方法

2.1大鼠分組和造模 構建糖尿病模型組，在實驗動物中心飼養SD 大鼠1周后，對大鼠禁食12 h，隨機選擇 12 只大鼠，腹腔一次性注射 STZ（65 mg/kg，溶劑為0.1 mmol/L檸檬酸鈉溶液，冰浴）。設立正常對照組，取6只大鼠腹腔注射等量的0.1 mmol/L濃度的檸檬酸鈉溶液。給藥7 d后進行糖尿病模型結果檢測，對大鼠禁食 6 h 后，尾靜脈采血，血糖≥16. 7 mmol/L認定為造模成功。飼養20周后，根據體質量、血糖采用數字表法將造模成功的大鼠分為模型組、給藥組。灌胃給藥12周，給藥組每日7. 7 g/kg（為臨床用量7倍）；正常組和模型組給予等體積蒸餾水。

2.2檢測方法與檢測指標

2.2.1免疫組化處死大鼠后，取眼球在4% 的多聚甲醛溶液中固定，需要采用LSAB法，多克隆抗體濃度為Notch1（1：50）及Dll4（1：100）。常規石蠟切片脫蠟，從高到低濃度梯度酒精水化；自來水沖洗10 min，PBS 5 min洗3次，3% H2O2氧化15 min后，自來水沖洗10 min，PBS 5 min洗3次；4℃ 濕盒孵育一抗（多克隆抗體Notch1及Dll4）12 h，PBS 5 min洗3次；室溫濕盒孵育二抗2 h；PBS 5 min洗3次；DAB顯色，自來水反復沖洗；隨即蘇木素復染30 s，自來水沖洗10 min ；從低到高濃度梯度酒精脫水，二甲苯溶液透明 15 min 2次后，滴加中性樹脂封片，用熒光倒置顯微鏡并使用Image-Pro-Plus 6.0軟件觀察、拍照及數據分析，需得出Notch1以及Dll4 的積分光密度值（integral optical density，IOD）。

2.2.2Hes1 蛋白表達水平的檢測 使用 Western blot 的方法，在大鼠的視網膜組織加入預冷的 RIPA 裂解液，勻漿，在高速離心機15 000 r/min、4 ℃離心20 min，棄下層物質取上清，采用 BCA 法檢測蛋白濃度。然后SDS-PAGE 電泳分離蛋白，電轉移至 PVDF 膜，在含5%脫脂奶粉的 TBST 中室溫封閉2 h后，需要 TBST 漂洗3次，每次10 min，然后加入一抗，在 4 ℃ 條件下孵育過夜；然后 TBST 漂洗3次，每次10 min，再次加入二抗，室溫放置 2 h；滴加ECL發光液于PVDF膜上，通過化學發光檢測目的條帶，利用凝膠圖像分析儀及Image Lab軟件分析PVDF膜上條帶，以目的蛋白/β-actin比值為目的蛋白表達相對水平。

2.3數據統計 使用統計學方法，SPSS 20.0軟件數據分析，以均數±標準差（± s ）的形式表示數據，采樣one-way ANOVA法，比較多樣本均數，P＜0.05視為具有統計學意義。

3　結果

3.1活血解毒方對 Notch1、Dll4 表達的影響 由免疫組化的結果可以看出，正常組中 Notch1 主要分布于視網膜神經節層與內網層 ；模型組中 Notch1 在視網膜神經節層、內網層、內核層、外核層、色素上皮細胞層均有所表達，Notch1 的含量高于正常組（P＜0.05）；活血解毒方組與正常組分布近似，Notch1 表達水平少于模型組（P＜0.05）。正常組視網膜中 Dll4 在神經節層、內網層、內核層及色素上皮細胞層中表達，模型組與活血解毒方組均表達在視網膜神經節層、內網層、內核層、外核層、色素上皮細胞層中，模型組 Dll4 表達水平高于正常組（P＜0.05），活血解毒方組 Dll4 表達水平少于模型組（P＜0.05）。見表1，圖1～2（插頁一）。

表 1 各組大鼠視網膜中Notch1、Dll4表達比較（± s ，n = 6）

表 1 各組大鼠視網膜中Notch1、Dll4表達比較（± s ，n = 6）

注：放大倍數400倍；與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別　Notch1　Dll4正常組　0.1606±0.02295　0.2139±0.02281模型組　0.4175±0.1616#　0.2499±0.02259#活血解毒方組　0.1207±0.4869△　0.2175±0.02438△

3.2活血解毒方對 Hes1表達的影響 用 Western blot法檢測正常組、模型組、活血解毒方組視網膜組織中Hes1 表達水平，與正常組相比，模型組的Hes1 表達上調（P＜0.05）；與模型組相比，活血解毒方組 Hes1表達下調。見圖3。

圖3　活血解毒方對Hes1蛋白表達水平的影響

4　討論

Notch 信號通路是一條在進化上高度保守、廣泛存在的，調節后生動物體內相鄰細胞間的直接信號傳導的信號通路。在1917年，Morgan 等人在果蠅體內首次發現了 Notch 基因；在1983年，成功的克隆出了該基因，并發現其可以編碼跨膜受體，命名為 Notch 受體[6]。隨后多年的研究發現，在多種物種中存在Notch信號，例如無脊椎動物、哺乳動物等。

Notch 信號通路主要由3部分構成，分別為受體、配體及細胞內效應器分子CSL-DNA結合蛋白。在哺乳動物體內，目前已經可以檢測出4種 Notch 受體的同源基因（ Notch1-4 ）和5種配體 （Jagged1和2，和Delta-like1、3和4）。Notch 信號產生是通過細胞受體與配體間相互作用，經剪切后，胞內段（NICD）釋放至細胞質，由胞質進入核內，結合轉錄因子CSL，形成轉錄激活復合體，激活下游轉錄抑制因子家族的靶基因，如Hes、Hey、Herp 等，促進該通路的生物學作用[7]。最終影響了細胞的分化和增殖以及凋亡。

Notch信號通路對血管形成、發育及生理功能等方面產生重要作用。研究表明，基因敲除 Notch 1和/或Notch 4 的純合子小鼠均在胚胎期10.5 d因為嚴重的血管發育缺陷死亡，例如卵黃囊發育不良、大量的胚胎期出血、擴大的心包囊結構、胎盤發育受損等[8～12]。另外有研究證明，Notch 信號缺失小鼠可觀察到大量血管生成，但是卻伴隨著嚴重的血管滲漏和出血，提示缺失 Notch 信號會導致血管功能嚴重受損[13]。

視網膜內有大量血管，因此 Notch 信號通路對視網膜內血管的形成發揮重要作用。Dll4 僅在血管內皮細胞中表達，Notch / Dll4 能抑制新生血管的內皮細胞向尖端細胞（ tip cell ）分化。在抑制 Notch 的活性或者敲除 Dll4 的小鼠中，視網膜血管內皮細胞分化后，導致尖端細胞過多生長，進而顯著促進毛細血管網的出芽、分枝以及融合[14-15]。雖然 Notch 信號通路影響視網膜血管形成，但其作用于糖尿病視網膜病變機制并無科學闡釋。本實驗通過免疫組化發現，正常組視網膜組織中 Notch 信號通路成員僅見少量表達，而在糖尿病視網膜病變組織中 Notch 信號通路配體 Dll4 和受體 Notch1 表達增加。Western blot 結果表明，下游基因 Hes1 的蛋白含量在糖尿病視網膜病變組織中較正常組明顯增強。糖尿病視網膜病變發展過程復雜，其中由于高血糖與低氧環境的雙重持續刺激作用，可能會導致 Notch 信號通路被激活，促進其成員 Notch1 和Dll4 以及 Hes1 的合成與釋放得到增多，從而對病變的發生發展起促進作用。

本實驗進一步分析了活血解毒方對 Notch 信號通路的影響，結果發現與模型組比較，活血解毒方組降低 Notch1、Dll4、Hes1 的含量，提示活血解毒方改善糖尿病大鼠視網膜病變可能與干預 Notch 信號通路有關。前期課題組曾證實，活血解毒方促進色素上皮衍生因子的水平[16]，抑制了血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、 血 管 緊 張 素 Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）及內皮素-1（Endothelin-1，ET-1）的表達[17]。有文獻報道，腎細胞癌內皮細胞中 VEGF 可增加 Dll4 基因及蛋白水平的表達[18-19]。另外 AngⅡ 刺激小鼠足細胞或血管平滑肌細胞后，可使Notch 通路被激活，Notch1 的活化形式 NICD1 及其下游基因 Hes1 表達增加[20]；而阻斷 AngⅡ 后，Notch 通路則被抑制[21]。至今已經知道的內源性縮血管物質中ET 是最強的，能夠促進血管收縮，加速平滑肌細胞增殖[22]；在星形膠質細胞中，ET-1 可促進 Jagged1 表達，調節 Notch 激活[23]。綜合文獻及本課題組的實驗結果，筆者推測在 DR 的發病發展過程，VEGF、AngⅡ、ET-1 可能通過調控了 Notch 信號通路來影響內皮細胞的增殖或分化，因此導致了新生血管的形成；而活血解毒方可能由于抑制了 VEGF、AngⅡ、ET-1 而阻斷Notch 信號通路，減少了新生血管的生成，從而延緩DR 的進程。但是這種設想仍需進一步實驗驗證。

本實驗闡述了活血解毒方對 Notch 信號通路的作用，有助于揭示活血解毒方的藥理機制，為活血解毒方臨床治療 DR 提供可靠的實驗依據。但是 Notch信號通路的作用機制十分復雜，Notch 信號通路中的Jagged1、 NICD1 與 DR 的關系亟需深入研究，這對闡明 DR 的發病機制，探尋新的治療靶點具有重要意義。