抑郁癥大鼠海馬組織中硒元素結合蛋白1的表達及意義

趙 海1，宋繼文2，喬小東

(1.山西工人晉祠療養院，山西 太原 030025；2.山西省腫瘤醫院，山西 太原 030013；3.太原市中心醫院，山西 太原 030006)

抑郁癥是較為常見的心理障礙之一，隨著生活節奏的加快以及社會競爭的日益激烈，抑郁癥在全世界范圍內的發病率呈逐年增高的趨勢[1]。硒(Se)是一種微量元素，但在機體內發揮著非常重要的作用，是抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成成分，Se在抗氧化、抗衰老、免疫調節等方面發揮重要的作用，有研究表明：硒元素的攝入不足與抑郁癥的發生有一定的關系，含硒化合物可減少抑郁癥小鼠的氧化應激和神經系統炎癥反應[2]。硒在體內主要以化合物的形式發揮作用，硒元素結合蛋白1(Selenium binding protein1，SBP1)是Se元素在體內發揮生物活性的重要媒介及結合蛋白，在精神分裂、抑郁障礙等疾病中，SBP-1基因拷貝數發生變異，腦組織中SBP-1的表達失調，提示其可能參與了身心疾病的病理過程[3]。本研究觀察了抑郁癥大鼠模型海馬組織中Se元素的含量及SBP-1蛋白的相對表達量，初步探討兩者與抑郁癥的相關性，現將結果整理報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級wistar大鼠購自山西醫科大學實驗動物中心，出生6周齡，雌、雄各20只，隨機分為兩組(模型組及對照組)，每組雌、雄各半。飼養條件：大鼠專用飼料及純凈水單籠飼養，溫度22℃，相對濕度50%，對照組大鼠光線12 h明暗交替。

1.2 試劑及主要儀器

Se元素標準溶液(濃度：1 000 μg/mL，國家標準物質研究中心)；SBP-1一抗(Abcam：ab91035)；內參GAPDH(美國santa-cruz：SC293335)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(武漢博士德)；全自動元素分析儀(美國海洋)；石墨爐原子吸收光譜儀(上海元析)；分光光度儀(日本Bio-rad)；電泳儀(北京六一)；轉膜儀(日本Bio-rad)；凝膠成像儀(上海天能)。

1.3 大鼠抑郁模型的建立及判定方法

模型組采用慢性不可預見性的應激(chronic unpredicted mild stress, CUMS)方法建立抑郁癥模型，具體方法參考文獻[4]。刺激內容包括禁食禁飲、電刺激、夾尾、懸吊、晝夜顛倒。每日給予一種刺激，每種刺激累計使用2～3次，順序隨機，使動物不能預料刺激的發生，持續6周。采用糖水偏好實驗和空場實驗(open field test，OFT)評價抑郁癥大鼠動物模型：a)糖水偏好實驗：每籠同時給予1%蔗糖水及純凈水各1份，1 h后計算蔗糖水消耗量。b)OFT實驗：將大鼠單獨置于長100cm，寬100 cm，高50 cm的空場箱，底面劃分為25個等邊方格，計算機記錄大鼠5 min內水平穿格、垂直穿格次數及逃避潛伏時間。

1.4 血清硒元素含量的測定

實驗6周時，取大鼠尾靜脈血1 mL，室溫靜置10 min，5 000轉離心10 min，取上清液，全自動元素分析儀檢測硒元素含量。

1.5 海馬組織硒元素含量的測定

造模6周后，斷頭處死大鼠，開顱后迅速取出海馬組織，電子天平稱取海馬組織25 mg(濕重)，烘箱將組織烘干，其余迅速置于低溫冰箱中用于western-blot實驗。將組織置于硝酸與高氯酸體積比為4∶1的消化液中充分混勻，去離子水定容至10 mL。采用Se元素標準溶液稀釋，分光光度計檢測吸光度值，Se元素工作曲線為Y=0.047 5X+0.021 7 (r=0.999 7)，采用石墨爐原子吸收光譜儀進行元素含量檢測。

1.6 海馬組織中SBP-1的表達量的測定

電子天平稱取海馬組織25 mg，加入組織裂解液，冰上勻漿至稀糊狀，4℃離心機，12 000轉離心5 min，吸取上清液，BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%SDS，分離膠濃度10%)，電壓100 v電泳45 min。將凝膠蛋白轉膜至硝酸纖維素膜，電壓100 v，轉膜35 min。一抗4℃過夜反應(SBP-1濃度1∶300，GAPDH濃度1∶500)，二抗室溫反應1 h(濃度均為1∶5 000)。電化學發光液反應，凝膠成像儀曝光顯色。Bandscan軟件分析條帶灰度值，SBP-1表達量=SBP-1灰度值/GAPDH灰度值。

1.7 統計學方法

采用SPSS18.0統計軟件進行分析，兩計量資料的比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 對照組及模型組行為評價及糖水偏好比較

與對照組相比，模型組大鼠的逃避潛伏時間延長，水平運動及垂直運動的評分降低；與對照組相比，模型組大鼠的糖水消耗降低；差異均有統計學意義(P<0.05)。上述結果表明慢性不可預見性應激誘導的抑郁癥大鼠模型建立成功。見表1。

2.2 大鼠血清及海馬組織中Se元素含量比較

對照組、模型組血清Se元素的含量依次為(0.19±0.04)μg/mL，(0.18±0.06)μg/mL，兩者相比差異無統計學意義(t=0.42，=0.68)；對照組、模型組海馬組織中Se元素的含量依次為(0.09±0.02)μg/mL，(0.08±0.02)μg/mL，兩者相比差異無統計學意義(t=0.88，P=0.22)。

2.3 大鼠海馬組織中SBP-1蛋白的表達

SBP-1在蛋白分子量52KD處出現顯影條帶，內參蛋白GAPDH在36KD處出現顯影條帶，與對照組相比，模型組大鼠海馬組織SBP-1蛋白的相對表達量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表2。

表1 慢性不可預見應激對wistar大鼠行為和糖水消耗的影響

圖1 對照組及模型組中SBP-1蛋白的表達(western-blot：C為對照組，M為模型組)

表2 大鼠海馬組織中SBP-1蛋白的相對表達量

組別SBP-1/GAPDHt值P值對照組0.44±0.08模型組0.15±0.065.910.00

3 討論

有關Se與抑郁癥的研究報道顯示，外源性提高Se的攝入量可降低抑郁癥的發生，成人血清Se的濃度與抑郁癥狀及負面情緒密切相關[5]。SBP-1是Se在機體內重要的結合蛋白，在免疫調節、抑制腫瘤細胞增殖等方面發揮著重要的作用，有研究提示Se與SBP-1可能與身心疾病的發生發展密切相關[6,7]。

本研究采用慢性不可預見性應激誘導大鼠抑郁癥模型，結果顯示，實驗6周時，模型組大鼠的糖水攝取較對照組降低，OFT實驗逃避潛伏期延長、運動評分下降，說明抑郁癥模型構建成功。大多數微量元素均在血清中以離子狀態和結合蛋白形式存在，血清學檢測是檢測微量元素病理性蓄積或減少的常用方法，本研究結果表明：模型組及對照組大鼠血清Se元素的含量無顯著差異。海馬是大腦負責記憶、學習等功能的重要區域，海馬區損傷、神經傳導異常、受體結合失調及應激性損害與身心疾病，尤其是抑郁癥的發生密切相關[8]，本研究原子吸收光譜實驗結果顯示海馬組織中對照組和模型組Se元素的含量也無差異，但western-blot結果表明模型組海馬組織中SBP-1蛋白較對照組下降，上述結果表明，在慢性不可預見應激誘導的大鼠抑郁模型中外周血及海馬組織中Se元素的絕對含量并無明顯降低， Se在抑郁大鼠海馬組織中可能是由于結合蛋白的下調而導致其利用受限。

綜上所述，本研究在抑郁動物模型中分析了Se及其結合蛋白SBP-1的表達模式，SBP-1的下調可能參與了抑郁癥的病理過程。值得注意的是，動物模型個體間差異較小，而人個體間差異較大，Se及SBP-1在人類抑郁癥中的作用可能與動物模型有所不同，并且Se的代謝途徑及結合蛋白多種多樣，其發揮作用的具體功能尚待進一步研究。