采用特制化學處理劑降解發酵藥渣中殘留四環素的研究

卜春苗，陳衛民

（1.寧夏大學化學化工學院，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學環境工程學院，寧夏銀川 750021）

寧夏地區由于氣候條件，糧食資源，能源資源非常適合發酵工業的發展。然而排放的大量廢水和廢渣也帶來了環境的嚴重污染和資源的浪費。如何使這些廢棄物得到無害化處理與有效的循環利用，是亟待解決的重要問題。但從目前對藥渣的無害化處理與資源利用狀況看，卻存在著嚴重的污染和利用不合理，大部分為禽畜所利用和肥田，少量廢棄直接排入下水，既造成資源的浪費，又污染環境，同時對食品的安全產生巨大的威脅。由此可見，發酵藥渣的無害化處理與資源利用已迫在眉睫。

四環素（tetracycline，TC）發酵藥渣是以淀粉、葡萄糖、蛋白胨為主要原料作培養基發酵提取藥物后的副產品，粗蛋白含量在48%以上，是非常有價值的動物蛋白飼料待開發的原料[1]。但是，原渣中含有微量的四環素，直接作為蛋白飼料原料利用，會造成動物產品中含有抗生素藥殘，存在食品安全隱患，必須降解處理后才可以利用。

目前，國內外對于環境水樣中殘留抗生素降解的研究報道較多，常采用的方法有光降解[2]、水解[4]、氧化降解[5]、生物降解[6]、吸附法[7]等。但是，對于抗生素藥渣治理與資源化方面的研究報道較少。

寧夏大學環境工程學院陳衛民課題組，經過多年的努力，研制出一種特殊的化學處理劑：經過脫脂、脫膠、脫臘、脫酸處理的大豆油脂（已獲授權發明專利，專利號：200610137031.7），提出采用理化復合技術，在確保藥渣固有的營養價值的基礎上實現降解藥渣中殘留四環素。本文重點考察所研制化學處理劑對四環素的降解性能，以四環素生產藥渣為研究對象，驗證對殘留四環素的降解效果，皆為四環素廢棄藥渣環保處理及資源化利用提供新的解決辦法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

LC-20AD液相色譜儀（Shimadzu）；Xevo TQ-S三重四級桿質譜系統；Oasis MCX多功能凈化柱（Waters）；B-400 均質儀（Buchi）；平行樣品濃縮儀（Buchi）；臺式冷凍離心機；超純水儀；漩渦混合器。四環素標準品（純度≥99%，Sigma）；甲醇、乙腈（色譜純，TEDLA）；乙酸銨（分析純，科密歐有限公司）。

1.2 四環素測定

1.2.1 配制標準儲備液 稱取25.00 mg四環素標準物質于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋即得250.00 mg/L，避光保存。

1.2.2 測定條件 色譜柱InertSustain HC-C18（4.6×150 mm，5 μm），檢測波長 355 nm；柱溫 35 ℃；進樣量20 μL；流動相為有機相（乙腈：甲醇=2：1）-水相（0.01 mol/L草酸）=35：65（V/V）；流速：1.0 mL/min。

1.2.3 標準曲線 分別移取250.00 mg/L TC溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL 于 50 mL 容量瓶中，甲醇定容得到 10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L 和 50 mg/L 標準溶液，采用HPLC測定標液峰面積，繪制標準曲線，線性方程：y=35 474.26X+70 364.8，R2=0.990 59。

1.3 降解實驗

以25 mg/mL四環素標準溶液為樣品，分別加入不同劑量的處理劑，在200 r/min攪拌下，不同時間內取樣靜止沉降30 min，于液面下1 cm處取上清液并測定其四環素含量。四環素含量采用高效液相色譜法測定，根據標曲計算殘留四環素含量，計算去除率。四環素去除率的計算公示如下

式中：C0－四環素藥渣中初始濃度；Ct－處理后殘留四環素濃度。

1.4 藥渣降解實驗測定

1.4.1 藥渣樣品降解 藥渣降解實驗在特制的反應容器中進行，在一定量藥渣樣品中加入不同用量的化學處理劑，收集藥渣樣品。

1.4.2 藥渣樣品測定 分別對原渣、降解藥渣樣品經過提取、凈化處理后，后用液相色譜-串聯質譜（LCMS/MS）分析。提取：稱取1.0 g原渣、降解藥渣樣品于50 mL離心管中，分別加入100 μL不同濃度四環素標準溶液（0.1 mg/mL，0.2mg/mL，0.3 mg/mL，0.4 mg/mL，0.5 mg/mL）和5 mL 4%氯化鈉溶液，充分勻漿后加入5 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取10 min。再加入10 mL乙酸乙酯，振蕩提取5 min，-4℃，12 000 r/min離心5 min，取上層有機相待凈化。凈化：Oasis MCX小柱，依次用3 mL甲醇和3 mL乙酸乙酯活化后，取5.0 mL上層有機相重力過柱，收集溶液。待過柱完成后，用2 mL乙酸乙酯淋洗，再用2 mL甲醇淋洗小柱，后用3 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液。將洗脫液置于氮吹儀上吹干，再用10%甲醇-水溶液定容至1 mL，渦旋30 s，采用0.2 μm GD/Nylon多層針頭式濾器過濾，后采用LC-MS/MS，測定處理藥渣中四環素殘留量。測試條件：ACQUITY BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫40℃，樣品室溫度20℃，流速0.3 mL/min，進樣體積5.0 μL，流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫，每個實驗平行3次，根據測定樣品中四環素殘留量，計算去除效率（見表1）。

表1 以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相梯度洗脫程序

2 實驗結果與討論

2.1 不同處理劑用量對TC降解的影響

實驗采用不同處理劑用量對250 mg/L TC溶液降解2 h，處理劑用量相對于TC的質量分數為：2%，4%，6%，8%和10%，處理劑用量對四環素的去除效果（見圖 1）。

圖1 處理劑用量對四環素降解率的影響

由圖1可知，當體系中TC濃度為56 μm，降解時間為2 h時，加入2%處理劑的量，TC降解率為44.86%，隨著處理劑用量的增加，TC去除率呈現上升趨勢，當處理劑增加至8%時，TC去除率為74.8%，但隨著處理劑用量的繼續增加，TC的去除率基本保持不變。

2.2 時間對TC降解的影響

繼續探討降解時間對TC去除率的影響，分別對56 μm的TC溶液加入不同處理劑用量，考察在降解時間為：0.5 h，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h，7 h，8 h，9 h，10 h，11 h，12 h下處理劑對TC的去除效果，結果（見圖2），結果顯示，在不同處理劑用量下，隨著降解時間的延長，TC的去除率逐漸上升，當降解時間為10 h時，在不同處理劑用量下，TC的去除率都達到最大值，而隨著時間的繼續增長，TC去除率基本保持不變。在2%，4%，6%，8%和10%處理劑用量下，TC的去除率最大分別能達到：52.64%、65.4%、77.03%、97.00%、95.98%，結果證明，10 h的降解時間，8%的處理劑用量，TC的去除效果最優。

3 用于藥渣實際樣品中四環素的去除

3.1 藥渣樣品中殘留四環素的檢測

進一步驗證處理劑對實際藥渣樣品的處理能力。在1.0 g藥渣樣品中加入20%、25%和30%（W/W）的特制處理劑，降解時間10 h，將降解藥渣樣品經提取、凈化處理后，提取液通過LC-MS/MS檢測，采用空白基質加標定量方法，對降解藥渣中四環素含量進行測定。四環素標液，原藥渣和藥渣降解后陽性樣品的對照譜圖（見圖3），可以看出，與原藥渣樣品譜圖進行對比，降解藥渣中四環素的峰明顯降低，證明處理劑具有去除藥渣中四環素的能力。

圖2 處理時間對四環素降解率的影響

3.2 藥渣樣品中四環素的去除

藥渣本身四環素的含量較高（225 μm～338 μm），根據2.1中考察處理劑用量與四環素去除率間的關系，在藥渣樣品中分別加入相對于藥渣樣品：20%、25%和30%（W/W）的處理劑量，測定藥渣中四環素的去除率，結果（見表2），加入20%、25%和 30%（W/W）的化學處理劑，降解10 h后，25%和30%的降解率為81.8%和82%，結果證明采用25%的化學處理試劑，能最大去除藥渣中四環素的殘留量。也表明，當處理劑應用于實際樣品藥渣中，由于體系的復雜性，與單一的四環素溶液相比，四環素的去除量稍有降低。

表2 化學處理試劑用量對藥渣中四環素的去除

圖3 標準四環素溶液、原渣和降解藥渣中陽性樣品的LC-MS/MS譜圖

3.3 化學處理-紫外光協助降解藥渣樣品中的四環素

圖4 紫外照射時間對四環素降解的影響

光降解是降解四環素的一種重要途徑。為了進一步提高藥渣中四環素的降解效果，擬采用光降解和化學處理劑相結合的方法，驗證對四環素的降解性能。研究已經證實254 nm紫外光照射對四環素具有較強的光解作用[5]，本文在加入25%的特制化學處理劑條件下，采用254 nm紫外光照射，分別測定0 h，5 h，10 h，15 h光照時間下藥渣中四環素的殘留量，計算去除率。結果（見圖4），隨著光照射時間的延長，四環素的降解率由81.8%提高到91%，實現了進一步提高四環素降解效果的目的，表明本文采用的化學處理-紫外光降解的方式在去除藥渣中殘留四環素方面具有潛在的應用價值。

4 結論

本文以降解藥渣中殘留四環素為目標，采用特制化學處理劑：大豆卵油脂，并結合254 nm紫外光照射相結合的方式，探討對四環素的降解性能，結果表明：

（1）采用特制化學處理劑（自制大豆卵油脂），8%的處理劑用量（W/W，相對于四環素），10 h下，可降解53 μm的四環素。

（2）將其用于四環素藥渣原樣中四環素的去除，加入25%的化學處理劑（W/W，相對于藥渣樣品），降解10 h，四環素的去除率最大能達到81.8%。

（3）為了進一步提高四環素的降解率，采用化學處理和紫外光降解相結合的方式。結果顯示，在20%的化學處理劑用量下，254 nm下采用紫外光照射，藥渣中四環素的降解率高達91%，高于目前文獻報道值，證明本文方法在降解四環素殘留中具有潛力。