結直腸癌KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因聯合突變分析及臨床意義

梁躍 李光學 馬慶慶

摘要 目的：探討結直腸癌組織KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變情況及與臨床病理特征的關系。方法：采用熒光定量PCR法檢測結直腸癌58例組織中KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變情況。結果：檢測到結直腸癌組織基因突變33例（56.90%），其中KRAS基因突變17例（29.31%），突變類型6種；NRAS基因突變1例（1.72%》，為G12D突變；PIK3CA基因突變9例（10.52%》，皆為H1047R突變；BRAF基因突變6例（10.34%），皆為V600E突變。PIK3CA僅與KRAS基因發生雙突變4例。KRAS野生型患者中PIK3CA基因突變4例。KRAS基因突變與病理分期有關。結論：結直腸癌臨床檢測中對KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF多基因突變進行分子檢測，能更準確地預測患者耐藥情況，可正確指導臨床用藥和科學選擇治療方案。

關鍵詞 結直腸癌；KRAS； NRAS； PIK3CA； BRAF；基因突變

結直腸癌是一種常見的惡性腫瘤。最新數據統計顯示，結直腸癌發病率居全球第3位，病死率居第4位[1]。目前化療是結直腸癌最主要的治療手段之一，然而近年報道結直腸癌化療的有效率僅30%[2]。目前對于結直腸癌的治療已進入了靶向治療時代，靶向治療藥物作用主要靶點之一是表皮生長因子受體（EGFR），EGFR與血管生成、腫瘤細胞增殖、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關，其下游信號轉導通路主要有Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK和PI3K/Akt/mTOR通路，抗EGFR抗體能阻斷其下游信號通路傳導，從而發揮抗腫瘤的作用。常用靶向藥物為EGFR的單克隆抗體西妥昔單抗和帕尼單抗。近年的研究表明，只有野生型KRAS基因患者才對抗EGFR單克隆抗體治療有效，而突變型的患者無效[3-5]。這表明EGFR下游信號通路中的其他基因突變可能導致結直腸癌患者無法受益[6]。因此，檢測與分析結直腸癌患者的KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等多基突變，能更準確地預測患者用抗EGFR單抗藥物的療效。本研究采用實時熒光定量PCR法（qRT-PCR）對58例貴州省內結直腸癌病灶組織中的KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA 4個基因位點進行檢測，分析基因突變情況，探討其臨床意義，指導結直腸癌的臨床個體化治療，為貴州省個體化靶向治療結直腸癌提供依據。

資料與方法

2015年10月-2017年6月收集結直腸癌石蠟包埋標本58例，男27例，女31例；年齡20-72歲，平均（45.52±1.25）歲。記錄已確診結直腸癌患者的年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓等一般疾病信息。

試劑與儀器設備：FFPE樣品DNA分離試劑盒，人類KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突變聯合檢測試劑盒，Nanodropl000微量核酸測定儀，ABI7500熒光定量PCR儀等。

方法：①提取石蠟切片DNA：取2-5片10μm的組織切片，利用二甲苯脫蠟，經離心處理后，取上清液加入1mL無水乙醇，震蕩離心后靜置沉淀，使用FFPE樣品DNA分離試劑盒，按照說明書步驟進行組織切片DNA的提取。DNA微量分光光度汁測定所提DNA的濃度及純度（OD260/OD280）。②實時熒光定量PCR擴增：以調整合適濃度的DNA為模板，使用人類KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突變聯合檢測試劑盒，在熒光定量PCR儀中進行實時熒光定量PCR擴增，檢測KRAS基因第2、3、4外顯子、NRAS基因第2和第3外顯子、PIK3CA基因20號外顯子和BRAF基因15號外顯子的熱點突變，記錄各樣本KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF4個基因突變情況。

統計學方法：本次研究中所有數據均采用SPSS 20.0統計軟件進行處理，計量資料采用（x±s）表示，計數資料采用率（%）表示，應用χ₂檢驗比較KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變率在不同年齡段、性別、腫瘤部位、淋巴結轉移、病理分期差異是否存在統汁學意義，P<0.05表示差異有統汁學意義。

結果

KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變情況：選取結直腸癌組織58例，共檢測基因突變33例（56.90%），KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變具體情況，見表1。

PIK3CA與KRAS基因出現雙突變4例，分別為H1047R與G12D雙突變3例，H1047R與G12V雙突變1例，雙突變占突變總數的12.12% （4/33），占PIK3CA突變的44.44%（4/9）。此外本研究未發現其他雙突變或三突變。

KRAS基因野牛型中NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變情況：41例KRAS基因野生型病例中NRAS基因突變0，PIK3CA基因突變4例，約占9.76%（4/41），BRAF基因突變0。

討論

近年在結直腸癌臨床治療中采用靶向治療取得了較好效果，目前常見靶向藥物為EGFR抑制劑西妥昔單抗和帕尼單抗等，EGFR信號通路在腫瘤的發生、發展中具有十分重要的作用，EGFR與其配體結合后，對下游的與細胞增殖、分化及凋亡、遷移等有密切關系的Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK和PI3K/Akt/mTOR信號通路進行激活。KRAS、NRAS和BRAF同屬RAS-RAF-MAPK信號通路。KRAS、NRAS同屬RAS家族，國內外報道KRAS基因突變率30%-40%，且常見突變發生在2號外顯子的第12、13位密碼子。NRAS基因報道相對較少，國內外研究發現CRC患者中NRAS基因突變率1.9%-3.9%。而作為RAF基因家族中的一員的BRAF，BRAF基因也是對西妥昔單抗和帕尼單抗耐藥的獨立影響因素，國內外研究報道的BRAF基因突變率1.8%-9.0%。本研究檢測出貴州省KRAS基因突變17例（29.31%），僅NRAS突變1例（1.72%），BRAF基因突變6例（10.34%）。KRAS突變主要發生在第12位密碼子上（14例，82.35%），未檢測到雙突變或三突變，在6種突變類型中G12D突變率最高[8例（47.06%）]；NRAS基因突變為G12D突變1例；BRAF基因突變皆為V600E突變6例。PIK3CA和KRAS基因突變可同時存在于同一癌組織標本中，而且KRAS野生型患者抗EGFR治療失敗可能有PIK3CA基因發生突變的原因。本研究檢測到PIK3CA基因突變9例（15.52%），皆為H1047R突變，PIK3CA與KRAS基因之間發生雙突變4例，結果與國內外報道基本一致。另外，KRAS基因野生型患者中發生PIK3CA基因突變4例，因此這部分KRAS野生型患者對抗EGFR藥物會產生耐受。

綜上所述，貴州省結直腸癌患者以KRAS基因突變率最高，PIK3CA、BRAF、NRAS基因突變較少見，PIK3CA和KRAS基因之間會交叉突變，而KRAS、NRAS和BRAF基因3者間基本不存在交叉突變；KRAS野生型患者耐藥可能由于PIK3CA基因突變。突變患者將不能從抗EGFR的靶向治療中獲益，建議結直腸癌患者在用靶向治療藥物（如西妥昔單抗等）之前應先對結直腸癌患者進行KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等多基因檢測，掌握基因的突變情況，正確選擇抗EGFR單抗藥，進行最有效的分子靶向治療。