結(jié)直腸癌KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因聯(lián)合突變分析及臨床意義

梁躍 李光學(xué) 馬慶慶

摘要 目的：探討結(jié)直腸癌組織KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變情況及與臨床病理特征的關(guān)系。方法：采用熒光定量PCR法檢測結(jié)直腸癌58例組織中KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變情況。結(jié)果：檢測到結(jié)直腸癌組織基因突變33例（56.90%），其中KRAS基因突變17例（29.31%），突變類型6種；NRAS基因突變1例（1.72%》，為G12D突變；PIK3CA基因突變9例（10.52%》，皆為H1047R突變；BRAF基因突變6例（10.34%），皆為V600E突變。PIK3CA僅與KRAS基因發(fā)生雙突變4例。KRAS野生型患者中PIK3CA基因突變4例。KRAS基因突變與病理分期有關(guān)。結(jié)論：結(jié)直腸癌臨床檢測中對(duì)KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF多基因突變進(jìn)行分子檢測，能更準(zhǔn)確地預(yù)測患者耐藥情況，可正確指導(dǎo)臨床用藥和科學(xué)選擇治療方案。

關(guān)鍵詞 結(jié)直腸癌；KRAS； NRAS； PIK3CA； BRAF；基因突變

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤。最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，結(jié)直腸癌發(fā)病率居全球第3位，病死率居第4位[1]。目前化療是結(jié)直腸癌最主要的治療手段之一，然而近年報(bào)道結(jié)直腸癌化療的有效率僅30%[2]。目前對(duì)于結(jié)直腸癌的治療已進(jìn)入了靶向治療時(shí)代，靶向治療藥物作用主要靶點(diǎn)之一是表皮生長因子受體（EGFR），EGFR與血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)，其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK和PI3K/Akt/mTOR通路，抗EGFR抗體能阻斷其下游信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。常用靶向藥物為EGFR的單克隆抗體西妥昔單抗和帕尼單抗。近年的研究表明，只有野生型KRAS基因患者才對(duì)抗EGFR單克隆抗體治療有效，而突變型的患者無效[3-5]。這表明EGFR下游信號(hào)通路中的其他基因突變可能導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者無法受益[6]。因此，檢測與分析結(jié)直腸癌患者的KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等多基突變，能更準(zhǔn)確地預(yù)測患者用抗EGFR單抗藥物的療效。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qRT-PCR）對(duì)58例貴州省內(nèi)結(jié)直腸癌病灶組織中的KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA 4個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測，分析基因突變情況，探討其臨床意義，指導(dǎo)結(jié)直腸癌的臨床個(gè)體化治療，為貴州省個(gè)體化靶向治療結(jié)直腸癌提供依據(jù)。

資料與方法

2015年10月-2017年6月收集結(jié)直腸癌石蠟包埋標(biāo)本58例，男27例，女31例；年齡20-72歲，平均（45.52±1.25）歲。記錄已確診結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓等一般疾病信息。

試劑與儀器設(shè)備：FFPE樣品DNA分離試劑盒，人類KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突變聯(lián)合檢測試劑盒，Nanodropl000微量核酸測定儀，ABI7500熒光定量PCR儀等。

方法：①提取石蠟切片DNA：取2-5片10μm的組織切片，利用二甲苯脫蠟，經(jīng)離心處理后，取上清液加入1mL無水乙醇，震蕩離心后靜置沉淀，使用FFPE樣品DNA分離試劑盒，按照說明書步驟進(jìn)行組織切片DNA的提取。DNA微量分光光度汁測定所提DNA的濃度及純度（OD260/OD280）。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增：以調(diào)整合適濃度的DNA為模板，使用人類KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突變聯(lián)合檢測試劑盒，在熒光定量PCR儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，檢測KRAS基因第2、3、4外顯子、NRAS基因第2和第3外顯子、PIK3CA基因20號(hào)外顯子和BRAF基因15號(hào)外顯子的熱點(diǎn)突變，記錄各樣本KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF4個(gè)基因突變情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本次研究中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，應(yīng)用χ₂檢驗(yàn)比較KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變率在不同年齡段、性別、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期差異是否存在統(tǒng)汁學(xué)意義，P<0.05表示差異有統(tǒng)汁學(xué)意義。

結(jié)果

KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變情況：選取結(jié)直腸癌組織58例，共檢測基因突變33例（56.90%），KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變具體情況，見表1。

PIK3CA與KRAS基因出現(xiàn)雙突變4例，分別為H1047R與G12D雙突變3例，H1047R與G12V雙突變1例，雙突變占突變總數(shù)的12.12% （4/33），占PIK3CA突變的44.44%（4/9）。此外本研究未發(fā)現(xiàn)其他雙突變或三突變。

KRAS基因野牛型中NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變情況：41例KRAS基因野生型病例中NRAS基因突變0，PIK3CA基因突變4例，約占9.76%（4/41），BRAF基因突變0。

討論

近年在結(jié)直腸癌臨床治療中采用靶向治療取得了較好效果，目前常見靶向藥物為EGFR抑制劑西妥昔單抗和帕尼單抗等，EGFR信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有十分重要的作用，EGFR與其配體結(jié)合后，對(duì)下游的與細(xì)胞增殖、分化及凋亡、遷移等有密切關(guān)系的Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路進(jìn)行激活。KRAS、NRAS和BRAF同屬RAS-RAF-MAPK信號(hào)通路。KRAS、NRAS同屬RAS家族，國內(nèi)外報(bào)道KRAS基因突變率30%-40%，且常見突變發(fā)生在2號(hào)外顯子的第12、13位密碼子。NRAS基因報(bào)道相對(duì)較少，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)CRC患者中NRAS基因突變率1.9%-3.9%。而作為RAF基因家族中的一員的BRAF，BRAF基因也是對(duì)西妥昔單抗和帕尼單抗耐藥的獨(dú)立影響因素，國內(nèi)外研究報(bào)道的BRAF基因突變率1.8%-9.0%。本研究檢測出貴州省KRAS基因突變17例（29.31%），僅NRAS突變1例（1.72%），BRAF基因突變6例（10.34%）。KRAS突變主要發(fā)生在第12位密碼子上（14例，82.35%），未檢測到雙突變或三突變，在6種突變類型中G12D突變率最高[8例（47.06%）]；NRAS基因突變?yōu)镚12D突變1例；BRAF基因突變皆為V600E突變6例。PIK3CA和KRAS基因突變可同時(shí)存在于同一癌組織標(biāo)本中，而且KRAS野生型患者抗EGFR治療失敗可能有PIK3CA基因發(fā)生突變的原因。本研究檢測到PIK3CA基因突變9例（15.52%），皆為H1047R突變，PIK3CA與KRAS基因之間發(fā)生雙突變4例，結(jié)果與國內(nèi)外報(bào)道基本一致。另外，KRAS基因野生型患者中發(fā)生PIK3CA基因突變4例，因此這部分KRAS野生型患者對(duì)抗EGFR藥物會(huì)產(chǎn)生耐受。

綜上所述，貴州省結(jié)直腸癌患者以KRAS基因突變率最高，PIK3CA、BRAF、NRAS基因突變較少見，PIK3CA和KRAS基因之間會(huì)交叉突變，而KRAS、NRAS和BRAF基因3者間基本不存在交叉突變；KRAS野生型患者耐藥可能由于PIK3CA基因突變。突變患者將不能從抗EGFR的靶向治療中獲益，建議結(jié)直腸癌患者在用靶向治療藥物（如西妥昔單抗等）之前應(yīng)先對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等多基因檢測，掌握基因的突變情況，正確選擇抗EGFR單抗藥，進(jìn)行最有效的分子靶向治療。