脂肪來源的干細胞移植對大鼠腦缺血組織的治療效果與機制初探

許秀秀，王杰華，陳淑增，李國前，楊小霞，洪諸權

(1.泉州醫學高等專科學校，福建 泉州 362011；2.福建醫科大學附屬泉州第一醫院神經內科，福建 泉州 362000)

腦缺血后的損傷機制復雜多樣，大量研究表明干細胞移植對腦缺血損傷可能具有令人鼓舞的治療效果。脂肪來源的干細胞 (Adipose-derived stem cell,ADSCs ) 不僅可以定向分化為神經組織細胞，而且還能分泌多種神經營養因子。且與其他干細胞相比，ADSCs具有低免疫原性、分離難度低、體外增殖速度快等突出優點。研究表明，ADSC移植對治療腦梗死有一定修復作用但其作用機制仍不清楚。生長相關蛋白-43(Growth associated protein-43,GAP-43)是一種廣泛存在于神經組織的特異性胞膜磷酸蛋白質。研究表明， GAP-43的表達能促進突觸的形成、功能的維持及遞質的釋放，被認為是神經元軸突生長發育的分子標記物，提示神經組織的損傷、修復或者再生[1]。本實驗將研究局部注射移植ADSC對大鼠大腦中動脈栓塞模型的治療作用并探討其可能機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物：選擇雄性SD大鼠，其中體重80～100 g的10只，用于獲取ADSC；體重250～280 g的36只，用于制作大鼠大腦中動脈栓塞模型。本研究大鼠均購于上海斯萊克實驗動物中心，動物合格證編號：SCXK(滬)012-0002。

1.1.2實驗試劑：L-DEME培養基來源美國Gibco公司；Percoll 淋巴細胞分離液來源美國Pharmacia公司；0.25%胰酶、胎牛血清(FBS)來源美國Hyclone公司；兔抗大鼠GAP-43一抗來源美國圣克魯斯生物技術公司；SP二步法免疫組化試劑盒、AEC染色試劑盒來源北京中山生物技術有限公司；β-actin和辣根酶標記IgG來源上海遠慕生物科技科技有限公司；Beyo ECL、Western熒光檢測試劑來源上海瑞齊實驗試劑有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠腦缺血模型的制備：將體重為250～280 g的大鼠進行隨機分成三組：假手術組、ADSC組和模型組。ADSC組和模型組用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈梗死模型[2]，造模后進行神經功能評分，得分為1～3分的大鼠方能進行實驗[2]。假手術組除了手術過程中不插入線栓外，其他手術步驟與模型組和ADSC組一致。

1.2.2ADSC分離及擴增、移植：將體重為80～100 g的SD大鼠，按課題組前期的實驗方法[3]進行ADSC的分離培養與傳代，取含1×106個第3代或第4代細胞的細胞懸液30 μl，在腦立體定位儀下對造模成功24 h的ADSC組大鼠經側腦室注射進行移植。

1.2.3神經功能評定：參照Longa的5分法[2]進行評定，各組大鼠分別在術后第7天和第14天處死前行神經功能評分。0分為無神經功能缺損癥狀。

1.2.4模型處理和標本取材：分別于造模后第7天、第14天進行模型處理。用10%水合氯醛腹腔麻醉后，迅速暴露心臟，經左心室進行心臟灌注沖洗，取出全腦，于冰盤上迅速分離取出右半球視神經交叉后6～11 mm部分備用。

1.2.5免疫組織化學法檢測GAP-43表達：按試劑盒說明的步驟進行檢測，大鼠腦組織切片常規脫蠟、水化，孵育、高壓修復，加入一抗兔抗大鼠GAP-43抗體(工作濃度約為1∶200)，孵育后再加入滴加生物素化小鼠抗兔的二抗，AEC顯色，封片。用0.01 mol/L PBS在各步驟間做5 min×3次的沖洗。隨機挑選5個視野，在高倍鏡下(400倍)進行陽性細胞數目的計數，計數后取其均值作為該組的陽性細胞數。

1.2.6Western blot法檢測GAP-43蛋白表達：取腦組織100 mg，按說明書進行蛋白提取，然后測定濃度。取25 μg蛋白進行蛋白變性、垂直電泳，轉膜封閉，按步驟加入一抗(兔抗大鼠GAP-43抗體，1∶1 500；兔抗大鼠β-actin抗體，1∶1 000)和二抗(1∶2 000)進行抗原抗體反應，ECL液顯色，呈像。測定條帶灰度值(Image J圖像分析)，比較目的蛋白灰度值和內參β-actin灰度值，并將兩者比值作為結果進行分析。

2 結果

2.1神經功能評分：假手術組術后無神經功能缺損癥狀，而模型組和ADSC組手術后則出現了明顯的神經功能缺損，至第14天逐漸減輕。ADSC治療組與模型組比較，第7天和第14天神經功能評分均較低，差異具有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

分組第7天第14天假手術組00模型組3.31±0.722.79±0.72ADSC組2.27±0.58①1.82±0.51①

注：與模型組比較，①P<0.05

2.2免疫組織化學法檢測GAP-43結果：如表2、圖1所示，假手術組GAP-43陽性細胞較少，模型組和ADSC治療組GAP-43陽性細胞表達較假手術組增加，ADSC治療組GAP-43陽性細胞明顯高于相應時間點的模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

分組第7天第14天假手術組7.21±0.786.82±1.03模型組35.69±5.62①26.36±3.57①ADSC組57.06±7.80①②42.78±6.56①②

注：與假手術組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

圖1 各組大鼠缺血側腦組織不同時間點GAP-43陽性細胞的表達(×400)：A為假手術組第7天；B為模型組第7天；C為ADSC組第7天；D為假手術組第14天；E為模型組第14天；F為ADSC組第14天

圖2 各組大鼠不同時間GAP-43蛋白的表達：1為假手術組；2為模型組；3為ADSC組；A為第7天；B為第14天

2.3Western blot法檢測GAP-43結果：如表3、圖2所示。假手術組GAP-43蛋白呈低水平表達，模型組和ADSC治療組GAP-43蛋白表達較假手術組增加，ADSC治療組GAP-43蛋白明顯高于相應時間點的模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。

分組第7天第14天假手術組0.16±0.010.18±0.02模型組0.62±0.12①0.27±0.09①ADSC組0.83±0.25①②0.52±0.19①②

注：與假手術組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

3 討論

腦細胞的損傷是永久和不可逆的，因而及時進行神經修復尤為重要。但是由于血腦屏障的存在，利用藥物來促進神經系統損傷修復的可能性微乎其微。組織工程的飛躍發展為這些傳統藥物難以治療的疾病帶來福音，干細胞的研究正是其熱點領域之一。干細胞的自我更新和多能分化能力對組織的修復有重要意義。脂肪來源的干細胞(ADSC)因其取材方便、來源豐富、較少引起免疫排斥、增殖速度快而受到廣大的關注[4-7]。有實驗證實了ADSC的分化能力，特別是向神經方向的分化能力。但是ADSC移植對損傷性腦缺血組織的具體機制尚未完全明確。

作為神經生長相關蛋白，GAP-43與軸突的生長密切相關，是軸突生長、發育的關鍵物質，也是神經損傷修復的標志物，對突觸可塑性具有重要意義，是研究突觸重塑變化的可靠指標。GAP-43具有一定的親水性，廣泛分布于中樞神經系統中。有研究認為，在發育中神經的分化、突觸的再生或神經損傷后的修復等發生時，突觸在形態或者結構上出現變化，可能導致GAP-43的高表達。在神經系統中GAP-43的高水平表達對神經元的生長、發育、再生等起到一定的促進作用[4]。故本實驗通過檢測GAP-43的表達來判斷腦缺血大鼠損傷發生及ADSCs移植治療后神經功能修復的可能性。

實驗發現，模型組大鼠大腦中動脈栓塞發生以后，腦梗死部位組織中GAP-43蛋白表達有明顯增加，說明機體的腦組織在發生缺血性損傷后有一定的可塑性，這種可塑性與突觸的重塑有關，可能是神經系統通過增加GAP-43的表達，從而進行突觸重塑，促進腦損傷后神經功能的修復。但是隨著缺血時間的延長，模型組GAP-43的表達雖然較假手術組仍有明顯升高，還是有表現出明顯的下降趨勢，神經功能缺損仍然較為明顯。且在術后第7天和第14天兩個不同的時間點，ADSC治療組比模型組腦組織中GAP-43蛋白表達增加更為顯著，神經功能缺損恢復明顯，說明大鼠腦損傷后自身進行的神經功能修復能力有限。而在大鼠發生腦缺血損傷后及時移植ADSC能更快促進神經功能的恢復。筆者推測移植的ADSC能通過增加GAP-43蛋白的表達，重建有利于神經再生的微環境以促進神經軸突的再生，從而促進神經損傷的修復。因此，缺血性腦損傷后，及時進行ADSC的移植對修復損傷性腦缺血組織，恢復神經功能有積極的促進作用。