超高效液相色譜法測定垂盆草顆粒中3種黃酮成分的含量

華燕青，張楠

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.西安市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710065)

垂盆草(SedumsarmentosumBunge)為景天科植物，全草入藥，具有清熱解毒，活血利濕的功效，可用于治療帶狀皰疹，毒蛇咬傷、燙傷、燒傷及急慢性肝炎濕熱淤結(jié)癥[1]。垂盆草中富含垂盆草苷、黃酮類、三萜類、生物堿等多種化學(xué)成分[2]。研究表明[3-4]，垂盆草總黃酮是垂盆草中重要的保肝降酶作用的活性成分之一，垂盆草總黃酮中含有槲皮素、山柰素、木犀草素、苜蓿苷、槲皮苷、金絲桃苷、木犀草苷、異鼠李素等多種黃酮類化合物。垂盆草顆粒為現(xiàn)行2015年版藥典一部收載品種[5]，其含量測定采用紫外-可見分光光度法，以蘆丁為對照測定了垂盆草顆粒中總黃酮含量。未分別對各成分進(jìn)行定量分析。為了客觀評價(jià)藥品的質(zhì)量，本研究自2015年12月至2016年6月建立了一種超高效液相色譜方法，同時(shí)測定垂盆草顆粒中三種黃酮類成分的含量，該方法高效準(zhǔn)確靈敏，可為提升垂盆草顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

DIONEX UltiMate3000 超高效液相色譜儀，四元分析泵，全自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，UV檢測器，Chromeleon7.2工作站，BT124S型電子天平(德國賽多利斯)，1號(hào)垂盆草顆粒(杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)康潤制藥有限公司)批號(hào)：150303，150502，2號(hào)垂盆草顆粒(上海靜安制藥有限公司)批號(hào)：150915-2，150409-2。對照品：槲皮素(批號(hào)100081-201408)，山柰素(批號(hào)110861-201310)，異鼠李素(批號(hào)110860-201109)，對照品均購于中國藥品生物制品檢定所，供含量測定使用，甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱Thermo Scientific AcclaimTM RSLC 120 C18(2.1 mm×100 mm，2.2 μm)，流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸(50 ∶50)；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：360 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 分別精密稱取對照品槲皮素、山柰素、異鼠李素適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得對照品儲(chǔ)備液，分別精密量取上述儲(chǔ)備液適量，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL約含0.513 0 mg的槲皮素，0.254 5 mg的山柰素，0.260 5 mg 的異鼠李素的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液 精密稱取垂盆草顆粒2.0 g，置索氏提取器中，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液(4 ∶1)的混合溶液25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1 h，取出放冷后，再稱定質(zhì)量，用甲醇-25%鹽酸溶液(4 ∶1)的混合溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3陰性對照溶液 按垂盆草顆粒制劑工藝方法，制備缺垂盆草的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下制備方法，制成陰性對照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各1 μL, 在“2.1”色譜條件下測定，理論板數(shù)分別以槲皮素、山柰素、異鼠李素計(jì)為18 000、10 015、9 800，各相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，陰性樣品對3個(gè)黃酮類成分的測定無干擾。各組分基線分離良好。色譜圖見圖1。

2.4線性范圍、最低檢測限和定量限分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μL，置于1 mL量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，作為系列對照溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定各成分的峰面積積分值，以對照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積積分值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，槲皮素、山柰素、異鼠李素回歸方程及相關(guān)系數(shù)等見表1，三種成分峰面積與進(jìn)樣量的線性良好。以3倍噪聲(S/N≥3)計(jì)算檢測限(LOD)，以10倍噪聲(S/N≥10)計(jì)算最小定量限(LOQ)，結(jié)果見表1。

2.5精密度試驗(yàn)取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.14%，0.32%，0.75%，表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取1號(hào)垂盆草顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置0、2、4、8、12、16、20、24 h時(shí)進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積，結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.17%，0.43%，0.82%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取1號(hào)垂盆草顆粒，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜峰。結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.24%、1.8%、0.96%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已測知含量的1號(hào)垂盆草顆粒樣品9份，每3份為一組，每份約1.0 g，精密稱定，按樣品含量的80%、100%和120%分別精密加入槲皮素、山柰素、異鼠李素對照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計(jì)算槲皮素、山柰素、異鼠李素的平均回收率，結(jié)果見表2。

注：A為對照品；B為樣品；C為陰性樣品圖1 超高效液相色譜圖

成分回歸方程R值線性范圍/μgLOD/μgLOQ/μg槲皮素Y=465.858X+0.0800.999 950^1 0000.381.21山柰素Y=432.942X-0.3000.999 920^4000.461.26異鼠李素Y=204.272X-2.7710.999 620^4000.751.52

2.9樣品含量測定分別稱取兩個(gè)廠家各2批樣品適量，精密稱定，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

目前文獻(xiàn)已報(bào)道的垂盆草顆粒中黃酮類成分的測定方法有高效液相色譜法[6-8]和紫外-可見分光光度法[3]。超高效液相色譜法[9]是一種采用亞2 μm小顆粒填料的液相色譜技術(shù)，根據(jù)范德米特方程理論，通過降低顆粒度提高柱效和分析速度，增加分析的通量、靈敏度及色譜峰容量, 與HPLC簡單方便的方法轉(zhuǎn)換，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)高效液相系統(tǒng)的不足。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜法進(jìn)行含量測定，在10 min以內(nèi)即完成三種黃酮類成分的分離及檢測，分析時(shí)間縮短了5倍，同時(shí)該法的流速僅為0.3 mL·min-1，進(jìn)樣體積為1 μL，流動(dòng)相用量僅約為28 mL，而高效液相色譜法流速多為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL或20 μL，流動(dòng)相用量較多。因此采取超高效液相色譜法進(jìn)行測定可節(jié)約分析時(shí)間，減少溶劑消耗，極大地降低分析成本，提高了檢驗(yàn)效率。

表2 加樣回收實(shí)驗(yàn)(n=9)

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=2)

本研究分別考察了甲醇、70%甲醇、甲醇-25%鹽酸(4 ∶1)三種提取溶劑，結(jié)果以甲醇-25%鹽酸(4 ∶1)為提取溶劑時(shí)3種成分的提取效率最高，并考察了索氏熱回流法、超聲提取法2種提取方式，30 min、45 min、1 h不同提取時(shí)間對黃酮成分提取率的影響，結(jié)果顯示索氏熱回流提取樣品1 h的提取效率最高，其有效成分含量較高、分離效果好。

參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]，分別考察了甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液、甲醇-0.4%冰乙酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液3 種流動(dòng)相系統(tǒng)，并用多種不同配比進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果采用甲-0.4%磷酸水(50 ∶50，V/V)為流動(dòng)相，黃酮類成分色譜峰的峰形及分離效果最好。

綜上所述，本研究所建立的超高效液相色譜法快速準(zhǔn)確高效，重復(fù)性好。可作為控制垂盆草顆粒質(zhì)量的有效方法。