單鏈抗體對豬流行性腹瀉病毒感染仔豬腹瀉保護作用初步研究

張凡慶 ，陳玉雪 ，楊 亮 ，朱建國

（1.上海交通大學農業與生物學院 上海 200240； 2.上海市獸醫生物技術重點實驗室，上海 200240； 3.上海富朗特動物保健股份有限公司，上海201502）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED） 是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemi c diarrhea virus，PEDV）感染引起的一種高度接觸性腸道傳染病。發病豬表現為水泄、嘔吐、脫水，甚至死亡［1］。各年齡段的豬都可以被感染，仔豬感染后癥狀最為嚴重，發病率和死亡率達到100%。PED最早在1971年英國的倫敦發生，之后在1978年才分離到第1株PEDV。我國在20世紀80年代首次出現了PED病情報道。該病在2010年以前為散發，沒有受到重視。2010年秋季以后，該病突然在我國出現了暴發，造成大量仔豬死亡，許多豬場甚至出現了沒有仔豬可養的狀態，造成了巨大的經濟損失。2013年該病又傳播至美國，對美國養豬業造成了沉重的影響［2，3］。

PEDV屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）， 冠 狀 病 毒 屬（Conronavirus）。病毒粒子呈圓形或橢圓形，具有囊膜，囊膜表面具有纖突。PEDV的基因組為28 000 nt，是目前已知的最大的動物RNA病毒。PEDV基因組具有7個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）， 編 碼四個結構蛋白和三個非結構蛋白，四個結構蛋白分別是纖突蛋白（Spike，S）、小膜蛋白（Envelope，E）、囊膜蛋白（Membrane，M）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid，N）［4］。這些病毒蛋白在PEDV的黏附、入侵、復制、組裝、出芽和免疫逃避中發揮了重要的作用。

單鏈抗體（single chain fragment variable， scFv）是一種基因工程抗體，它是將抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區通過一個短的柔性肽段連接而成［5］。scFv保留了抗原結合活性，分子量僅為完整抗體分子的1/6。由于scFv只有抗體的Fc片段，避免了使用過程中的種屬問題。目前通常使用噬菌體單鏈抗體展示技術篩選抗體，該方法將編碼的scFv通過基因工程的方法與噬菌體外殼蛋白基因偶聯，使scFv被外殼蛋白攜帶并展示在噬菌體的表面，然后通過篩選富集方法獲得具有親和力和特異性的重組噬菌體。

本研究對實驗室保存的一株抗PEDV的scFv的生物學特性進行了鑒定，并且在仔豬上研究了該scFv對PEDV的免疫保護效果，本研究對臨床預防和治療PEDV提供了一個思路。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞

PEDV上海崇明分離株由本實驗室保存。非洲綠猴腎（Vero）細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

Ni-NTA His標簽純化試劑盒購自美國Merck公司；DMEM高糖培養基、胰酶、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；FITC標記小鼠抗His標簽抗體、抗His標簽小鼠單克隆抗體、HRP標記羊抗小鼠二抗購自Abcam公司；低熔點瓊脂糖購自Thermo公司；TPCK處理的胰酶購自上海生工生物公司。

2 方法

2.1 scFv的純化

從-40 ℃冰柜中取出凍存的抗PEDV scFv 菌株（scFv 與 pET-28a（＋）載體連接），在2 × YT-K固體培養基上劃線。第2天挑取單個菌落至液體培養基中培養。使用Ni-NTA His標簽純化試劑盒進行純化， Elute buffer洗脫蛋白。取少量純化后的蛋白進行SDSPAGE分析。

2.2 scFv的特異性分析

取出實驗室保存的PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、圓環病毒2型（PCV2）、產腸毒素大腸桿菌K88和K99菌株，37 ℃包被96孔ELISA板。接著向每孔中加入純化的單鏈抗體 100 μL（10 μg/mL）， 孵 育 后 加入鼠抗His標簽一抗、PBST洗滌后加入HRP標記的羊抗鼠二抗。最后加入TMB顯色液，在酶標儀OD450nm處讀取數值。

2.3 scFv的免疫熒光實驗

將 1.2 ×105TCID50/mL 的 TGEV感染六孔板中的ST細胞，在無血清培養基中培養48 h。將ST細胞用4%多聚甲醛固定。依次加入scFv和FITC標記的抗His標簽二抗，在熒光顯微鏡下觀察結果。

2.4 scFv對仔豬腹瀉的保護實驗

取6頭21日齡長白仔豬，按以下處理分組。第1組1頭豬，為病毒處理組，先灌胃15 mL PBS，1 h后攻入2×106TCID50/mL的PEDV；第2組3頭豬，為scFv預防組，先灌胃15 mL濃 度 為 400 μg/mL的 scFv，1 h后攻入2×106TCID50/mL的PEDV；第3組1頭豬，用來評價scFv的生物安全性，先灌胃15 mL濃度為400 μg/mL的scFv，1 h后加入15 mL PBS；第4組1頭豬，為陰性處理組，先灌胃15 mL PBS，1 h后再灌為 15 mL PBS。

在實驗的第2、4、7天觀察仔豬發病情況，記錄精神狀態、腹瀉情況和死亡數量。

分別采集發病死亡的豬以及第7天處死豬的小腸，用生理鹽水清洗內容物后，取2～3 cm長的小腸組織置于10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后制作切片，HE染色后，在光學顯微鏡下觀察其病理學變化。

2.5 scFv對仔豬的生物安全性評價

分別在感染后第2、4、7天采集仔豬糞便5 g，加入少量PBS后離心，取上清液。ELISA包被PEDV全病毒抗原2 μg/mL，包被封閉后加入提取的糞便上清液，檢測糞便中scFv的含量。

3 結果

3.1 抗豬流行性腹瀉病毒scFv的純化

將復蘇的菌株接種至含有50 μg/mL卡那霉素的2×YT培養基中，37 ℃培養至OD600達到0.5時加入50 mmol的IPTG，30 ℃培養過夜。第2天收集離心的沉淀。使用超聲破碎儀破碎后，上清液加入Ni-NTA his標簽蛋白純化樹脂，純化蛋白。10% SDSPAGE電泳結果顯示在28 ku有特異性條帶，證實scFv被成功純化（見圖1）。

圖1 scFv的SDS-PAGE電泳

3.2 scFv的免疫熒光實驗

將1 MOI 的PEDV感染Vero細胞，24 h后加入4%多聚甲醛固定，接著加入封閉液和透化液，30 min后加入scFv，接著加入抗His標簽的熒光二抗，結果顯示scFv加入后細胞出現綠色熒光，陰性對照組沒有出現熒光（圖2）。

圖2 scFv的免疫熒光實驗

3.3 scFv的仔豬保護實驗

將6頭仔豬分為攻毒組，scFv免疫組、scFv對照組和陰性對照組。在感染后第2、4、7 天觀察臨床癥狀，結果見表1。從表1可以看出，PEDV攻毒組在攻毒后出現腹瀉，癥狀逐漸加重，并且食欲減少。scFv免疫組處理后，腹瀉癥狀顯著減輕，并且食欲正常。scFv對照組證實scFv使用不會引起仔豬腹瀉。此外，所有組沒有出現仔豬的死亡。

表1 仔豬發病情況

圖3 HE染色切片

第7天剖檢仔豬，可見PEDV攻毒組仔豬腸道充滿內容物和氣體，腸壁變薄。scFv免疫組仔豬腸道眼觀沒有變化。采集仔豬的小腸，石蠟包埋后染色。結果發現PEDV攻毒組的仔豬小腸絨毛上皮脫落，有炎性細胞浸潤。scFv＋PEDV、scFv和陰性對照組則沒有出現腸道損傷，說明scFv處理能夠對仔豬感染PEDV產生保護(見圖3)。

3.4 scFv的生物安全性評價

分別在感染后第2、4、7天采集仔豬糞便加入少量PBS懸浮，將離心的上清液進行ELISA檢測。結果表明單鏈抗體處理的仔豬糞便中未檢測到scFv，說明制備的scFv具有生物安全性（見圖4）。

圖4 scFv的生物安全性評價

4 討論

PEDV屬于冠狀病毒科，感染各年齡段仔豬，臨床癥狀表現為嘔吐、腹瀉和脫水。在2010年以前PEDV的預防以疫苗免疫為主，并取得了很好的效果。然而當2010年的秋季疫情暴發后，傳統疫苗效果不佳，大量仔豬發病死亡［6］。之后的測序發現2010年流行株的基因發生了變異，傳統的疫苗不能提供保護，因此迫切需要針對新型流行株的免疫/治療制劑。本研究的單鏈抗體針對流行性PEDV毒株，因此具有很好的臨床應用價值。

scFv具有特異性好，分子量低，能夠進行改造等特點。目前scFv廣泛應用于腫瘤、病原菌、毒素的診斷和治療。之前一些文獻報道了scFv對病毒也有抑制和治療作用。本文將實驗室獲得的scFv進行鑒定，證實該scFv具有中和病毒的效果。動物保護實驗證明，預先給仔豬口服scFv制劑后能夠阻斷病毒的入侵。本研究為scFv的推廣應用奠定了基礎。