Ski對(duì) 脂多糖誘導(dǎo)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響①

王明，楊新樂，陳鐵戈，張東亮，鞏朝陽，向高，劉開鑫，張海鴻

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.蘭州大學(xué)甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州市730030

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)損傷與神經(jīng)炎癥有密切關(guān)系[1-2]。神經(jīng)炎癥反應(yīng)過程以神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活和外周免疫細(xì)胞侵入為特征[3]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是CNS內(nèi)數(shù)量最多、分布最廣的免疫效應(yīng)細(xì)胞，不僅在正常CNS發(fā)揮許多功能，而且在CNS損傷及疾病中發(fā)揮重要作用[4-5]。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過產(chǎn)生炎癥因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等發(fā)揮作用[6]。研究星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的作用，對(duì)CNS損傷后功能恢復(fù)有重要意義。

Ski癌基因在1986年首次被認(rèn)定為Sloan-Kettering病毒基因組中的轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)雞胚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[7-8]。Ski是一種進(jìn)化保守蛋白，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)展過程[9]，在肝臟再生、血管平滑肌的增殖和骨骼肌的分化、傷口愈合等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Ski蛋白表達(dá)上調(diào)[11]，推測(cè)Ski可能與CNS炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾技術(shù)沉默Ski基因，觀察Ski對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

SPF級(jí)3日齡Sprague-Dawley大鼠，由甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

脂多糖(L6259)：美國SIGMA公司。小鼠抗大鼠Ski單克隆抗體(G8)sc-33693：美國SANTA CRUZ公司。Ski干擾RNA及陰性對(duì)照：THERMOFISHER公司合成。Lipofectamine?RNAiMAX Reagent：THERMOFISHER公司。FBS：德國PAN-BIOTECH GMBH公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶：美國GIBCO公司。RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、TritionX-100和SDS：碧云天公司。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)多克隆抗體、GAPDH多克隆抗體：美國PROTEINTECH公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、RBITC標(biāo)記山羊抗兔或小鼠IgG、山羊封閉血清、PVDF膜(0.45 μm)：SOLARBIO公司。ECL試劑盒：美國MILLOPORE公司。ELISA試劑盒：NEOBIOSCIENCE公司。

1.2 原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和純化

Sprague-Dawley大鼠置于75%乙醇中浸泡3 min。細(xì)胞操作臺(tái)上迅速取出大腦皮質(zhì)，置DMEM/F12液中漂洗，剝離腦膜和血管。將腦皮質(zhì)置于盛有胰酶的培養(yǎng)皿中剪碎，吹打至組織塊消散，37℃溫箱胰酶消化3 min；轉(zhuǎn)至離心管中，加完全培養(yǎng)基4 ml，1500 r/min離心8 min。棄上清，加DMEM/F12完全培養(yǎng)基4 ml，反復(fù)吹打，制成均一細(xì)胞懸液，種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換液，培養(yǎng)9～10 d，至細(xì)胞融合貼滿瓶壁。封口后37℃恒溫旋轉(zhuǎn)搖床210 r/min搖床6 h，除去懸浮細(xì)胞和貼壁不牢的細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組及處置

純化后的細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和siRNA組。siRNA組采用siRNA沉默Ski基因48 h。參照文獻(xiàn)[12]，以濃度1 μg/ml脂多糖刺激細(xì)胞24 h[13]，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測(cè)炎癥因子表達(dá)。

轉(zhuǎn)染前24 h，用胰酶消化細(xì)胞、計(jì)數(shù)，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，至細(xì)胞密度達(dá)80%。siRNA組采用siRNALipofectamine?RNAiMAX Reagent將Ski-siRNA轉(zhuǎn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞，陰性對(duì)照組采用siRNA Lipofectamine?RNAiMAX Reagent將陰性對(duì)照-siRNA(negative control-siRNA,NC-siRNA)轉(zhuǎn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞，空白對(duì)照組僅加入siRNA Lipofectamine?RNAiMAX Reagent。

Ski-siRNA序列：正義5'-GCC CUG AUU CGA GAC AGC UUC UAC U-3'；反義5'-AGU AGA AGC UGU CUC GAA UCA GGG C-3'。NC-siRNA序列：正義5'-UUG UGG CCU GUU AGC UUC AGA GCG A-3'；反義5'-UCG CUC UGA AGC UAA CAG GCC ACAA-3'。

參照說明書提供的方法進(jìn)行操作，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，采用Western bloting及免疫熒光染色檢測(cè)Ski表達(dá)。

1.4 免疫熒光染色

將原代星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于蓋玻片后，用GFAP多克隆抗體行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)計(jì)為星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度。星形膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)95%以上符合實(shí)驗(yàn)要求。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用Ski單克隆抗體行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察Ski沉默效果。

PBS清洗接種于蓋玻片的細(xì)胞3遍，4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗3遍，0.3%TritionX-100通透20 min，PBS洗3次；10%山羊血清封閉30 min；吸干封閉液，滴加兔抗大鼠GFAP多克隆抗體(1∶100)或小鼠抗大鼠Ski單克隆抗體(1∶100)，4℃冰箱孵育過夜。PBS洗3次，避光加RBITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶300)或山羊抗小鼠IgG(1∶300)，37℃溫箱避光孵育90 min。PBS清洗3次，滴加DAPI，避光室溫孵育20 min，PBS洗2次。甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Western blotting

轉(zhuǎn)染48 h后，各組細(xì)胞PBS洗2次，加RIPA裂解液裂解細(xì)胞30 min，提取蛋白；BCA檢測(cè)總蛋白量后，行10%SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至甲醇浸透的PVDF膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h。TBST洗3次 ， 每 次 10 min。 加 入 Ski(1∶ 200)、 GAPDH(1∶2500)一抗，4℃過夜；TBST洗膜3次；37℃下滴加山羊抗小鼠二抗(1∶5000)，孵育2 h；TBST洗膜3次；滴加發(fā)光液，通過X膠片獲得蛋白信號(hào)，Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的相對(duì)灰度。每組測(cè)3次。

1.6 ELISA

收集各組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA試劑盒按照操作說明書檢測(cè)TNF-α和IL-1β的濃度。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)復(fù)孔測(cè)3次，取均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)及純度鑒定

取純化后的細(xì)胞少許種植于多聚賴氨酸包被的玻片上，24 h后觀察細(xì)胞貼壁良好。GFAP免疫熒光染色，鏡下觀察GFAP陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)百分比95%，符合實(shí)驗(yàn)要求(圖1)。

2.2 Ski沉默效果

2.2.1 免疫熒光染色

siRNA組Ski表達(dá)量較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組降低，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組Ski表達(dá)無明顯差異(圖 2)。

2.2.2 Western blotting

siRNA組Ski蛋白表達(dá)水平比空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著降低(P＜0.001)；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組Ski表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。見圖3、表1。

圖1 體外培養(yǎng)細(xì)胞純度鑒定(GFAP免疫熒光染色,200×)

圖2 細(xì)胞Ski沉默效率(Ski免疫熒光染色,100×)

表1 各組Ski表達(dá)

圖3 各組Ski表達(dá)(Western blotting)

2.3 脂多糖刺激后TNF-α和IL-1β的分泌

siRNA組TNF-α和IL-1β濃度顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P＜0.001)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

表2 各組TNF-α和IL-1β濃度比較(pg/ml)

3 討論

炎癥反應(yīng)是CNS損傷及退變性疾病發(fā)展過程中重要的病理反應(yīng)[1-2]；在CNS病理過程中，抑制炎癥反應(yīng)可能有助于減少細(xì)胞損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[14]。

過去認(rèn)為活化的小膠質(zhì)細(xì)胞是炎癥因子的主要來源細(xì)胞[15]。但近來研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。在活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，促炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6顯著升高[16]。這些細(xì)胞因子既可以誘導(dǎo)神經(jīng)元變性，刺激膠質(zhì)瘢痕形成，阻礙神經(jīng)元修復(fù)再生[17]，又能進(jìn)一步活化膠質(zhì)細(xì)胞，使其產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)[18]。在眾多促炎因子中，TNF-α和IL-1β是關(guān)鍵的炎癥因子，介導(dǎo)上游和下游多條炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[19]。

例如：在“研究碰撞系統(tǒng)動(dòng)量變化規(guī)律”時(shí)，為了體現(xiàn)探究的完整性，筆者曾嘗試過將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)探究和理論分析放在一節(jié)課上完成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于時(shí)間倉促，學(xué)生并沒有真正掌握數(shù)據(jù)處理的方法，而理論分析也由于時(shí)間倉促而流于形式。而后將“理論分析”讓學(xué)生在課外探究，結(jié)果表明，這種處理方式其實(shí)是兩全其美的。學(xué)生在課堂上既能充分理解、掌握實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的科學(xué)處理方法，同時(shí)還能激發(fā)課外進(jìn)行理論探究的興趣。

脂多糖是革蘭氏陰性菌胞壁的主要成分，是有效的全身炎癥誘導(dǎo)因子，可用于體外模擬革蘭氏陰性細(xì)菌感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)[20]。星形膠質(zhì)細(xì)胞存在Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)，脂多糖可與TLR4結(jié)合發(fā)揮致炎作用，并活化星形膠質(zhì)細(xì)胞[21]。

Ski參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、造血細(xì)胞的增殖和分化、腫瘤發(fā)生、肌肉分化及再生等多種病理生理過程[22]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Ski表達(dá)上調(diào)，具有時(shí)間和濃度依賴性[11]；Ski還對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移發(fā)揮重要作用[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)[24]，Ski與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)，而此通路廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)過程[25]。我們推測(cè)，Ski可能通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移。

脂多糖刺激可使星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子生成顯著升高，TNF-α可進(jìn)一步促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，并且促進(jìn)其他炎癥細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6)的產(chǎn)生，而IL-1β又能加強(qiáng)TNF-α的作用，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)迅速放大[26-27]。

本研究采用siRNA技術(shù)，將特異針對(duì)Ski序列的siRNA轉(zhuǎn)染大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞Ski表達(dá)顯著降低；隨著Ski表達(dá)下調(diào)，星形膠質(zhì)TNF-α和IL-1β分泌明顯減少，提示Ski在星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面起重要作用。

綜上所述，利用siRNA靶向干預(yù)Ski基因，可抑制炎癥因子的分泌，阻止炎癥效應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大，從而可能為CNS損傷治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

本研究證明，Ski可能是一種調(diào)節(jié)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的新型分子。但Ski調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。進(jìn)一步研究將探討Ski調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的信號(hào)通路，為治療CNS炎癥相關(guān)疾病尋找新的途徑。