miR-222調控PARP-1在高糖致人腎臟系膜細胞tPA/PAI-1紊亂中的作用

朱恒梅 祝勝郎 陳結慧 楊蕓 李金艷

糖尿病腎病(DN)是一種以腎小球系膜增寬及小球硬化為特征的疾病，是導致終末期腎病的主要原因之一[1]。組織型纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物-1(tPA/PAI-1)是主要的纖溶酶原/纖溶酶系統，不僅能直接降解細胞外基質，還能激活金屬蛋白酶間接降解細胞外基質，在糖尿病腎小球硬化中發揮重要作用[2]。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)是一類能選擇性識別并結合DNA缺口的DNA結合蛋白酶[3-5]。筆者前期研究顯示，高糖可通過過度激活PARP誘導tPA/PAI-1功能紊亂，促進細胞外基質增生，提示其在糖尿病病程中可能發揮重要作用[6-8]。微小核糖核酸(miR)是一類高度保守的非編碼單鏈RNA分子，約由22個核苷酸組成，能與靶基因3’-非編碼區特異性結合，在轉錄后水平調控基因的表達，從而導致靶mRNA降解和翻譯阻遏。既往研究顯示，多種miR在糖尿病中異常表達[9-12]。目前研究發現，miR-222是重要的腫瘤相關基因，調控腫瘤細胞周期、增殖及侵襲[13]。近期有研究表明，miR-222可能參與糖尿病的發生[14-15]。Neijenhuis等[16]報道，hsa-miR-222能增強PARP-1抑制劑對癌細胞PARP-1的敏感性。因此，本研究以人腎臟系膜細胞(HMC)作為研究對象，探討miR-222在高糖致tPA/PAI-1紊亂中對PARP-1的調控作用。

材料與方法

一、 材 料

人HMC由吳斯佳碩士惠贈。D-Glucose購自Sigma公司，miR-222模擬物(miR-222 mimics)hsa-miR-222成熟體序列(5’-AGCUACAUCUGGCUAC-UGGGU-3’)、陰性對照(5’-AAAAGAGACCGGUUCACUGUGA-3’)均購于上海吉瑪生物公司；miR VanaTMPARlSTM試劑盒購自ABI公司、iScripTM模板DNA合成試劑盒購自BIO-RAD公司、QPCR熒光定量試劑盒購自Takaka公司。細胞培養用RPMI 1640培養基、胎牛血清購自Gibco公司；胰島素購自甘李藥業，Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；細胞裂解液、辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗大鼠二抗購自Cell Signaling公司，兔抗大鼠PARP-1一抗購自Chemicon公司；tPA、PAI-1 ELI-SA試劑盒購自上海太陽生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司，Taq DNA聚合酶購自Takaka公司。其余化學試劑為國產分析純。

二、方 法

1.靶基因預測

Targetscan生物學信息網站預測PARP-1是人miR-222的靶基因，并找出其可能結合的位點，見圖1。

圖1 hsa-miR-222與PARP-13’-非翻譯區結合的位點

2.細胞培養及分組

HMC培養于含有15%胎牛血清及0.6 U/ml胰島素的RPMI 1640培養基中。細胞培養至85%融合后，換用無血清培養基培養24 h，后換用新鮮無血清的DMEM培養基，并分成4組：正常糖(5 mmol/L)組、高糖(25 mmol/L)組、高糖+miR-222 mimics陰性對照組、高糖+miR-222 mimics組。

3.miR-222表達水平的檢測

采用實時定量PCR檢測高糖(25 mmol/L葡萄糖)刺激24 h下HMC的miR-222表達，采用正常培養基(含5 mmol/L葡萄糖)培養HMC的作對照，每組設3個樣品，每份樣品重復檢測3次。先利用miR VanaTMPARlSTMKit提取包括miR在內的總RNA。采用iScripTM模板DNA合成試劑盒逆轉錄為模板DNA，然后使用QPCR熒光定量試劑盒進行定量PCR，每份樣本設3個復孔，具體按說明書操作，最后使用ABI750實時定量PCR儀檢測miR-222的相對表達量。

4.目的miR的轉染

轉染前1日，2 ml無抗生素培養基中接種(2.5～10)×105個HMC，待細胞融合度達到70%后，準備轉染。使用250 μl Opti-MEM低血清培養基稀釋4 μg目的miR(所有對照組加入等量的無菌水)并輕輕混勻；250 μl Opti-MEM低血清培養基稀釋10 μl Lipofectamine 2000轉染試劑，輕輕混勻后室溫靜置5 min，將稀釋好的目的miR及轉染試劑溶液混合(總體積500 μl)，輕輕混勻并室溫下靜置20 min，每孔中加入500 μl混合液，十字交叉法搖動細胞培養板使溶液與培養基充分混勻，置入37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h后，更換新鮮培養基，再轉移入培養箱繼續培養24 h。

5.PARP-1含量的檢測

按實驗分組將HMC轉染miR-222 mimics陰性對照組及miR-222 mimics，使用蛋白免疫印跡法檢測24 h后PARP-1蛋白表達。收集各組細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入細胞裂解液, 冰上放置5 min。用細胞刮刮取細胞，收集至1.5 ml Eppendorf管中，放置于冰上。用超聲粉碎儀在冰上進行超聲粉碎，500 W、1 s共15次，剪切DNA，降低黏稠度。4 ℃、12 000轉/分離心10 min，留取上清液。取10 μl上清液測定濃度，余儲存于-80℃備用[1-2]。上述上清液加蛋白載樣緩沖液，煮沸10 min，瞬時高速離心，分別取不同樣品的總蛋白50 μg經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，電轉移至聚丙氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h， 加入PARP-1的抗體，4 ℃過夜。洗膜后，再加HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后進行顯色，曝光于X線膠片上，圖像分析系統進行灰度掃描，用Fluor Chem 8900軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數字化。以 β-actin為內參，用目的蛋白條帶灰度值與內參灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達含量[12]。

6.tPA、PAI-1含量的檢測

細胞培養液上清液中tPA、PAI-1的含量按照ELISA試劑盒(上海太陽生物技術有限公司)說明書步驟檢測[1-2]。

三、統計學處理

結 果

一、高糖刺激下HMC細胞miR-222的表達

實時定量PCR顯示，高糖組HMC在24 h時miR-222 mRNA表達水平是正常糖組的(2.537±0.216)倍，組間比較差異有統計學意義(t=12.325，P<0.001)。

二、miR-222對HMC細胞PARP-1表達的影響

多組間比較差異有統計學意義(F=15.934，P<0.001)，其中高糖組HMC中PARP-1蛋白表達高于正常糖組(P<0.05)，高糖+miR-222 mimics組HMC中PARP-1蛋白表達低于高糖組(P<0.05)，而高糖+miR-222 mimics陰性對照組與高糖組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 miR-222對HMCk PARP-1蛋白表達的影響

三、miR-222對HMC細胞上清液tPA及PAI-1蛋白表達的影響

多組間比較差異有統計學意義(FtPA=56.846、FPAI-1=127.385、FtPA/PAI-1=94.947，P均<0.001)，其中與正常糖組比較，高糖組的tPA和tPA/PAI-1降低、PAI-1升高(P均<0.05)；與高糖組比較，高糖+mimics組的tPA和tPA/PAI-1升高、PAI-1降低(P均<0.05)。高糖+miR-222 mimics陰性對照組與高糖組tPA、PAI-1及tPA/PAI-1比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，見圖3。

圖3 miR-222對HMC細胞上清液tPA/PAI-1的影響

討 論

DN是糖尿病主要的并發癥之一，是發達國家終末期腎病的首要病因，也是我國終末期腎病的第二大病因，社會危害性極大。DN以腎小球系膜基質增寬及毛細血管基底膜增厚為主要特征。DN的發病過程中，細胞外基質(ECM)堆積是其病理損害的關鍵。tPA/PAI-1是一對主要的纖溶酶原/纖溶酶系統，PAI-1是tPA的天然的抑制劑。糖尿病時，tPA/PAI-1功能紊亂，可下調tPA表達，上調PAI-1表達，遏制纖溶系統的功能，減少纖溶酶酶原活化，從而減少纖維蛋白/纖維蛋白原降解，抑制ECM降解，在糖尿病ECM沉積中發揮重要作用[17]。筆者前期研究表明，高糖刺激大鼠腎小球系膜細胞分泌的tPA蛋白有所下降，PAI-1蛋白明顯增加，tPA/PAI-1比值降低，證實糖尿病時tPA/PAI-1功能紊亂[6]。

早期研究報道參與調節多種腫瘤發生的miR-222，近年也有較多報道證實其參與糖尿病的調節。有研究表明，2型糖尿病及妊娠期糖尿病患者外周血miR-222-3p明顯下調[18-19]。另一研究顯示，2型糖尿病患者外周血miR-222明顯上調[20]。Li等[21]報道，選擇性下調miR-10a、miR-139b、miR-206和miR-222的表達，糖尿病和高脂血癥誘導的炎癥反應可以上調聯接蛋白connexin和Rho激酶的表達。Lightell等[15]報道，增加細胞外信號調節激酶1/2活性可反應性上調miR-221和miR-222，并促進糖尿病中的新內膜增生。Tsukita等[22]研究顯示，miR-106b和miR-222有助于骨髓移植胰腺B細胞增殖，并改善胰島素缺乏型糖尿病小鼠模型中的高血糖癥。Neijenhuis等[16]研究亦顯示，hsa- miR-222過表達可抑制RAD51表達，損害細胞同源重組功能，進而增加對PARP抑制劑olaparib的敏感性。

PARP是一類能選擇性識別并結合DNA缺口的DNA結合蛋白酶。主要分布于細胞核內，少量分布于細胞漿內。PARP-1是由1 014個氨基酸組成的多肽鏈，分子量為113 kDa。它是PARP家族中含量最豐富，也是最重要的成員[23]。筆者前期研究表明，PARP-1存在于腎小球系膜細胞中，高糖誘導腎小球系膜細胞PARP-1生成增加，同時下調tPA/PAI-1比值，并上調ECM4型膠原、纖連蛋白的表達；PARP-1特異性抑制劑(PJ34)能下調PARP-1表達，同時部分逆轉上述因子的改變[6-7]。PARP-1還參與了血管緊張素Ⅱ誘導的腎小球系膜細胞PAI-1與纖連蛋白表達[8]。上述研究表明，PARP-1是DN發病機制中的一個重要因子。

本研究顯示，高糖可上調HMC的miR-222，提示miR-222可能參與調節糖尿病的發生、發展。研究通過對HMC細胞轉染miR-222 mimics，有效下調其靶蛋白PARP-1的表達，進一步表明miR-222可靶向調節PARP-1。研究還顯示，HMC細胞轉染miR-222 mimics，可明顯改善tPA/PAI-1表達的紊亂。因此，miR-222可能過靶向調控PARP-1基因促進系膜細胞纖溶酶原/纖溶酶系統的紊亂，這為DN發展的可能分子機制提供了新的科學依據。