PD-1/PD-L1通路在七氟醚致大鼠術后認知功能障礙中的作用

余高鋒 李會仁 金尚怡

術后認知功能障礙(POCD)是麻醉和術后出現的一種中樞神經系統并發癥，其臨床癥狀主要包括認知能力降低、理解水平下降、記憶減退等[1-2]。研究證實七氟醚與POCD的發生有密切聯系，七氟醚致POCD的機制與β-淀粉樣蛋白(Aβ)刺激膠質細胞產生炎癥因子和細胞因子有關[3-4]。程序性死亡受體1(PD-1)參與細胞凋亡并可從多個層面阻止T、B淋巴細胞的激活[5-6]。PD-1與其內源性配體程序性死亡受體配體1(PD-L1)結合后發揮作用，但PD-1/PD-L1通路在七氟醚致POCD中的作用尚未明確。本研究旨在探討PD-1/PD-L1通路在七氟醚致大鼠POCD中的作用。

材料與方法

一、動物及分組

取18只4月齡清潔級雄性SD大鼠，體質量為260～290 g，購自廣東省動物實驗基地。在動物房內飼養7 d，室溫25 ℃，濕度40%，不控制飲水，常規飲食。將其隨機分為3組各6只，包括生理鹽水組(NS組)、七氟醚致POCD組(POCD組)和PD-1/PD-L1通路阻斷組(B組)。

二、方 法

1.七氟醚致POCD模型制備

于大鼠海馬區注射Aβ1-40制備模型，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg進行麻醉，應用大鼠腦立體定向儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)定位雙側海馬CA1區，鉆開顱骨暴露硬腦膜，用微量進樣器(上海激光醫學儀器廠)從腦表面定位點垂直進針，依次將Aβ1-40(5 μg/μl，使用前37 ℃孵育7 d)2 μl注入POCD組及B組大鼠雙側海馬，注射時長5 min，留針5 min，確保Aβ1-40完全浸潤局部組織，NS組則等速注射等體積生理鹽水。注射完后所有實驗大鼠局部消毒后縫合皮膚，腹腔注射慶大霉素2萬單位后常規飼養。B組大鼠海馬內注射PD-L1單克隆抗體E1J2J 1 μl(貨號15165S，美國CST公司)，POCD組和NS組大鼠海馬內注射等體積生理鹽水。術后30 d按文獻[7]制備七氟醚致POCD模型，給予POCD組和B組大鼠2.0最低肺泡有效濃度(MAC)的七氟醚+氧氣(濃度50%)處理4 h；NS組空氣處理4 h。各組氣體流量均設為2 L/min。

2.行為學測定及標本制備

大鼠術前5 d開始Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所)行為學實驗訓練，4次/日，持續5 d。以池壁上4個等距離點把水池平分成4個象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，在Ⅳ象限中心位置安放平臺，直徑15 cm，高度33 cm，沒入水下1 cm。大鼠從上述4個象限面向池壁入水直至其找到平臺，運用any-Maze動物行為學自動攝像分析系統記錄大鼠游泳速度、逃避潛伏期、上臺前路程以及搜索策略。若90 s內未發現平臺，則引導其登上平臺休息30 s，并將逃避潛伏期記為90 s。于術后51 d行Morris水迷宮行為學測試，測試后予各組大鼠腹腔注射水合氯醛350 mg/kg進行麻醉，開顱灌流取其海馬組織進行測定。

3.大鼠海馬細胞凋亡熒光原位檢測

采用原位缺口末端標記法(TUNEL)，按照試劑盒說明操作。使用Image-pro Plus 6.0軟件進行分析，鏡下細胞核棕色染色細胞為陽性細胞，每只大鼠取3張切片,各切片在損傷區任意釆集5個高倍(400倍)視野。高倍視野下計算凋亡指數=調亡細胞數/總細胞數×100 %。

4.蛋白免疫印跡法測定海馬內PD-1及PD-L1的表達

用細胞裂解液提取蛋白后采用Bradfor法蛋白定量測定試劑盒(上海美季生物技術公司)進行蛋白定量。通過Scion Image軟件檢測PD-1和PD-L1目的條帶，對比內參照β-actin條帶灰度值，其比值為PD-1和PD-L1的相對表達量。

5.ELISA法測定IL-1β和IL-10的含量

用勻漿器研磨組織后于冰浴下超聲波粉碎制勻漿，4 ℃離心取上清液，參照ELISA測定試劑盒說明，測定IL-1β、IL-10含量。用MK3酶標儀測吸光度OD值，對應標準曲線得出IL-1β和IL-10的含量。

三、統計學處理

結 果

一、大鼠Morris水迷宮行為學測試結果

術后51 d，與NS組比較，POCD組及B組大鼠上臺前路程增加、逃避潛伏期延長(P均<0.05)；與POCD組比較，B組大鼠上臺前路程減少、逃避潛伏期縮短(P均<0.05)；3組大鼠游泳速度比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

二、NS組、POCD組及B組大鼠海馬內PD-1、PD-L1、炎癥因子及神經元細胞凋亡率比較

與NS組比較，POCD組大鼠海馬內PD-1和PD-L1表達增強、炎癥因子IL-1β含量增加、抑炎因子IL-10含量減少、神經元細胞凋亡率升高(P均<0.05)；與POCD組比較，B組大鼠海馬內PD-L1表達減弱、炎癥因子IL-1β含量減少、抑炎因子IL-10含量增加、神經元細胞凋亡率降低(P均<0.05)；POCD組與B組大鼠海馬內PD-1比較差異無統計學意義(P均>0.05)，見表2。

表1 NS組、POCD組及B組大鼠術后51 d Morris水迷宮行為學測試結果比較

注：與NS組比較，aP<0.05; 與POCD組比較，bP<0.05

表2 NS組、POCD組及B組大鼠海馬內PD-1、PD-L1、炎癥因子及神經元細胞凋亡率比較

注：與NS組比較，aP<0.05;與POCD組比較，bP<0.05

討 論

雙側海馬注射Aβ1-40可致大鼠海馬神經元線粒體受損并導致其記憶減退和認知障礙[8]。本研究采用既往研究方法制備七氟醚致大鼠POCD模型，大鼠認知行為學的改變提示海馬區注射Aβ1-40后復合七氟醚處理，可導致大鼠發生POCD。海馬是學習記憶的重要核團，海馬內Aβ沉積、神經元細胞外Aβ沉積是早老性癡呆的主要病理特征。Aβ能直接激活膠質細胞分泌和釋放TNF-α、IL-1、IL-6、集落刺激因子、環氧化酶2和前列腺素等炎癥趨化因子，最終導致神經元變性壞死[9-10]。七氟醚處理可激活大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體，增加鈣離子內流并促進大量氧自由基生成，從而誘發海馬神經元細胞凋亡和脂質過氧化損傷，七氟醚可通過抑制突觸后膜乙酰膽堿傳遞的方式抑制神經元突觸可塑性[11-13]。此外，七氟醚能刺激Aβ的聚集與沉積，對老年大鼠空間學習及記憶能力產生傷害[14-15]。本研究結果表明，NS組大鼠海馬內炎癥反應以及PD-1與PD-L1的含量均處于較低水平，而POCD組大鼠海馬內炎癥反應加重并最終導致神經元細胞凋亡，同時其PD-1和PD-L1表達增強，這種伴隨性升高提示PD-1/PD-L1通路參與了POCD過程。

PD-1蛋白由N端細胞外結合域、跨膜結構域和C端胞漿結構域3部分組成，胞漿結構域中含有一個免疫受體酪氨酸交換模體和一個免疫受體酪氨酸抑制模體[16-17]。當PD-L1與PD-1受體結合后，可促進PD-1胞漿結構域尾端酪氨酸磷酸化，繼而招募非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-2)，最終SHP2可使T淋巴細胞抗原受體相關蛋白CD-3ζ和ζ鏈相關蛋白-70去磷酸化，從而調控了下游病理生理過程，一方面抑制炎癥因子的分泌， 另一方面抑制PI3K/Akt、mTOR、S6、Erk2等信號通路的激活[18-20]。在本研究中，POCD大鼠海馬內炎癥因子IL-1β含量增加，同時炎癥因子IL-10含量減少，導致神經元細胞凋亡，通過給予PD-L1單克隆抗體，抑制PD-L1與PD-1的結合從而阻斷PD-1/PD-L1通路后，上述病理生理過程得以反轉，提示PD-1/PD-L1通路是調控POCD炎癥反應和細胞凋亡的上游關鍵通路。

綜上所述，PD-1/PD-L1通路在七氟醚致大鼠POCD中起關鍵作用，阻斷PD-1/PD-L1通路可抑制POCD大鼠海馬內免疫炎癥反應，從而降低神經元細胞凋亡率。