香椿老葉黃酮的響應面優化提取及其抗氧化研究

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(許昌學院 食品與生物工程學院，河南 許昌 461000)

香椿[Toonasinensis(A.Juss.)Roem]又名香椿芽、香樁頭、椿天等，屬楝科香椿屬落葉喬木，是藥食兩用植物，在河南、山東、安徽等多地種植[1,2].香椿葉含有黃酮、多酚、三萜類等活性成分[3-5]，具有抑菌、抗氧化、降血糖和抗腫瘤等作用[6,7].市面上現有香椿醬、干制香椿芽、香椿茶和香椿咸菜等產品[1,8].目前，香椿的消費以嫩芽為主，老葉常被廢棄.因此，香椿老葉的開發利用具有重要意義.

目前，化學合成物是食品主要的抗氧化劑，植物源抗氧化劑受到普遍關注[9].黃酮類物質作為抗氧化劑具有廣闊的應用前景[10].香椿葉中含有豐富的黃酮類物質，用正交實驗法優化香椿葉黃酮的超聲波提取工藝已見報道[11]；但是基于響應面分析的香椿老葉黃酮的超聲波提取工藝未見研究.因此，本研究就對香椿老葉黃酮的響應面優化提取及其抗氧化性能進行研究.

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

香椿老葉：2016年8月采摘于河南九棵樹農業發展有限公司；蘆丁標準品：純度99.7%，中國藥品生物制品檢定所.乙醇、Vc、Al(NO3)3、NaOH、NaNO2、FeCl3、3,5-二硝基水楊酸等均為分析純.

1.2 儀器與設備

電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備公司；超聲波提取機，濟寧天華超聲電子儀器有限公司；紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司.

1.3 研究方法

1.3.1 黃酮含量的測定

采用NaNO2—Al(NO3)3—NaOH比色法測定黃酮含量[12].

1.3.2 單因素試驗

香椿老葉于鼓風干燥箱(50 ℃)中干燥后，粉碎并過60目篩.取1.00 g香椿老葉粉，研究不同的乙醇濃度(20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%)、料液比(15，110，120，130，140，150，160 g/mL)、提取時間(10，20，30，40，50，60，70 min)、提取溫度(30，40，50，60，70，80 ℃)和提取功率(320，400，480，560，640，720 W)對香椿老葉黃酮提取率的影響.

1.3.3 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取料液比(X1)、提取時間(X2)、提取功率(X3)為影響因素，采用Box-Behnken試驗設計，以黃酮提取率(Y)為響應值，進行3因素3水平正交試驗，優化香椿老葉黃酮的提取條件.

1.3.4 抗氧化指標測定

根據上述得到的最優工藝，提取香椿老葉黃酮，并烘干(50 ℃)，然后配制成不同濃度的黃酮溶液.測定黃酮的體外抗氧化活性，包括總還原能力[13]、DPPH自由基清除率[14]、ABTS自由基清除率[15]和·OH清除率[16-17].

1.4 數據處理

試驗重復3次，使用軟件DPS 7.05和Design Expert 8.0.5進行數據統計與分析.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

由圖1可知，當乙醇濃度小于40%時，黃酮提取率隨著乙醇濃度的升高而逐漸增加；當乙醇濃度為40%～80%時，提取率則逐漸下降.原因是香椿老葉黃酮隨著乙醇濃度的變化，其極性也發生變化，40%乙醇的極性與香椿老葉中黃酮的極性相近，此時的黃酮提取率最高；但是乙醇濃度過高，又會使雜質(如糖類、色素、脂溶性物質等)溶出，干擾黃酮的提取.因此，確定超聲波提取香椿老葉黃酮的最佳乙醇濃度為40%.

2.1.2料液比對黃酮提取率的影響

由圖2可知，當料液比逐漸增大時，香椿老葉黃酮的提取率先增加后降低.當料液比為130(g/mL)時，黃酮的提取率達到最大值；繼續增加料液比，提取率則逐漸下降.原因是料液比在一定范圍時，隨著提取液料液比的增加，黃酮的溶出也逐漸增加；當固體和液體接觸飽和后，再增加提取溶劑的量，雜質就會溶出；另外，料液比越高，后續濃縮工藝需要的時間會更長.因此綜合考慮，確定提取香椿老葉黃酮的最佳料液比為130(g/mL).

圖1 乙醇濃度對香椿老葉黃酮提取率的影響

圖2 料液比對香椿老葉黃酮提取率的影響

2.1.3 超聲時間對黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著超聲波提取時間的延長，香椿葉黃酮的提取率逐漸增加；當提取時間為40 min時，提取率最高；再延長提取時間，香椿老葉黃酮的提取率則降低.原因是隨著時間的延長，超聲波會產生較多的熱量，黃酮類化合物的結構將會遭到破壞；而且超聲波振幅也會破壞黃酮類化合物的結構.綜上所述，確定超聲波提取香椿老葉黃酮的最佳時間為40 min.

2.1.4 超聲溫度對黃酮提取率的影響

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，香椿老葉黃酮的提取率也逐漸增加；當提取溫度為50 ℃時，黃酮的提取率最高；當提取溫度繼續升高，香椿老葉黃酮的提取率逐漸下降，其原因是溫度過高會使黃酮類化合物降解，但溫度過低不利于黃酮類化合物的溶出.因此確定超聲波提取香椿老葉黃酮的最佳溫度為50 ℃.

圖3 提取時間對香椿老葉黃酮提取率的影響

圖4 提取溫度對香椿老葉黃酮提取率的影響

2.1.5 超聲功率對黃酮提取率的影響

由圖5可知，當超聲波功率為400 W時，香椿老葉黃酮的提取率最大；功率繼續增加，提取率則逐漸下降.原因可能是功率過高，超聲產生的瞬間高溫會破壞黃酮化合物結構，導致雜質溶出，從而影響提取效果.因此確定超聲波提取香椿老葉黃酮的最佳功率為400 W.

2.2 超聲波提取工藝條件的優化

試驗因素水平見表1，表2為Box-Behnken試驗結果.用軟件Design Expert 8.0.5對表2數據進行分析，以香椿老葉黃酮提取率(Y)為固定量，以料液比(X1)、提取時間(X2)和提取功率(X3)為因變量，建立數學模型方程為

Y=-0.966 85+78.108 20X1+0.224 05X2-0.013 381X3-1.343 20X1X2+0.071 975X1X3+
0.000 002 875X2X3-552.016 00X12-0.002 104 78X22+ 0.000 013 913 7X32.

(1)

圖5 超聲功率對香椿老葉黃酮提取率的影響

表1 響應面試驗因素水平表

表2 試驗分析方案及結果

由表3可知，回歸模型差異極顯著(P=0.004 7)、失擬項差異不顯著(P>0.05)，說明該模型擬合度好，可用該模型分析和預測香椿老葉黃酮的提取率.F檢驗用來判定回歸方程中各變量對響應值的影響顯著性，概率P越小，相應變量的顯著程度越高.A、AB、B2極顯著，B、C2顯著.回歸方程相關系數R2為0.918 1(校正后R2為0.812 8和變異系數為3.29)，說明該模型滿足了91.81%的樣本空間.

表3 方差分析表#

注：#**，P<0.01，表示差異極顯著；*，P<0.05，表示差異顯著.

為客觀反映料液比與提取時間(AB)的交互作用對香椿老葉黃酮提取率的影響，以其中兩個響應變量為x軸和y軸，響應值香椿老葉黃酮提取率為z軸，繪制等高線圖和三維響應面圖，如圖6所示.

圖6 料液比(A)和提取時間(C)對香椿老葉黃酮提取率(Y)交互影響的等高線圖(a)和響應面圖(b)

對式(1)做進一步分析，得到超聲波提取香椿老葉黃酮的最優參數為：料液比為120、提取時間為37.61 min、提取功率為480 W，預測香椿老葉黃酮的提取率為3.044%.用最優參數來提取香椿老葉黃酮，測得提取率為(3.051±0.029)%，說明響應面法的優化工藝參數是可靠的.

2.3 香椿老葉黃酮的抗氧化活性

圖7為香椿老葉黃酮的總還原能力及·OH、DPPH和ABTS自由基清除率.可知，在所測定的濃度范圍內，香椿老葉黃酮具有一定的抗氧化能力.隨著黃酮濃度的升高，其總還原能力、DPPH 自由基清除率和ABTS自由基清除率均增大，且呈劑量效應關系；但是對·OH的清除能力差異不明顯.香椿老葉黃酮可作為天然食品抗氧化劑，與相關文獻[18-20]結論一致.

圖7 香椿老葉黃酮的·OH清除率注:a為總還原能力，b、c為DPPH自由基清除率，d為ABTS自由基清除率.

3 結論

(1)香椿老葉黃酮的超聲波提取最優工藝參數為：料液比為1：20(g/mL)、提取時間為37.61 min、提取功率為480 W，預測香椿老葉黃酮的提取率為3.044%(接近測定值3.051%).

(2)香椿老葉黃酮具有一定的抗氧化作用.在一定濃度范圍內，香椿老葉黃酮對·OH、DPPH自由基和ABTS自由基具有一定的清除能力.

(3)香椿老葉中黃酮類化合物提取工藝及其抗氧化能力的研究為香椿資源的開發利用提供理論依據.試驗中所用的是黃酮粗提液，可能含有多酚、多糖、蛋白質、纖維素等物質，香椿老葉中黃酮的組成、結構以及純化等仍需進一步研究；另外，本文的抗氧化實驗是體外評價，還需通過細胞實驗和動物實驗評價抗氧化能力.