褪黑素對博來霉素誘導肺纖維化小鼠α-SMA和E-cadherin表達的影響

胡青青，周恩敏，金克，杜勇，錢燕，翁華春

（溫州醫科大學附屬第一醫院 兒科，浙江 溫州 325015）

肺纖維化是許多急性和慢性肺病的常見終末期后遺癥，是一種進行性肺病[1]。盡管近年來肺纖維化的治療有所進展，但大多數患者仍然面臨病死的結果，目前唯一的治愈性治療是肺移植[2]。因此，對肺纖維化機制進一步研究并尋找合適的治療靶點是必要的。褪黑素由松果體等器官合成，廣泛分布于生物體內[3]。研究表明，褪黑素具有抗氧化、抗癌以及免疫調節作用[4]。YEUNG等[5]研究表明，褪黑素可以抑制慢性間歇性缺氧誘導的心肌損傷大鼠纖維化標志物的表達，如TGF-β。DAS等[6]報道褪黑素干預可以消除脂毒性介導的肝星狀細胞活化并防止肝纖維化進展。但是目前關于褪黑素對肺纖維化的作用尚未見相關報道，本研究旨在探討褪黑素對博來霉素誘導的肺纖維化小鼠的影響及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 博來霉素粉劑由日本化藥株式會社生產，規格15 mg/支，溫州醫科大學附屬第一醫院藥劑科提供；褪黑素購自美國Sigma公司；氧化應激試劑盒購自南京建成公司；本實驗所使用反轉錄及RT-PCR相關試劑均購自大連TaKaRa公司；RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）引物由深圳華大基因公司合成；單克隆抗小鼠E-cadherin抗體、單克隆抗小鼠α-SMA抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；HRP標記的兔抗小鼠IgG購自上海碧云天生物公司；免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組：雄性SPF級C57BL/6小鼠30只，6周齡，20 g左右，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。用博來霉素（5.0 mg/kg）氣管內注射制作大鼠肺纖維化模型[7]。隨機分為模型組和褪黑素組，每組15只。褪黑素組腹腔注射5.0 mg/kg褪黑素，模型組腹腔注射同等體積的0.9%氯化鈉溶液。4周后處死小鼠，提取肺組織進行相關指標檢測。本研究動物實驗方案由溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。

1.2.2 HE染色評估肺組織病理改變：將肺組織進行固定并常規石蠟包埋，將從肺組織的不同部位收集的3個組織塊切片至5 μm的厚度。HE染色按照試劑盒說明書操作，用來評估肺組織的病理變化（肺泡炎和肺纖維化）。

1.2.3 肺組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量測定：將肺組織用0.9%氯化鈉溶液在冰上勻漿，然后在4 ℃以4 000 r/min離心10 min。上清液用于進一步測量。SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定。根據生產商的說明書使用檢測試劑盒檢測。

1.2.4 免疫組織化學檢測肺組織中α-SMA和E-cadherin表達：將肺組織固定并常規石蠟包埋，連續切片，厚度約5 μm。切片脫蠟至水，用檸檬酸鈉進行抗原修復，用3%雙氧水滅活內源性氧化酶，加入一抗（1:100）孵育后，加入二抗繼續孵育，用DAB溶液進行顯色，蘇木素復染后封片。視野下棕黃色顆粒為陽性結果，觀察蛋白在肺組織中的表達情況。

1.2.5 RT-PCR檢測肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-6以及α-SMA和E-cadherin mRNA的表達：Trizol法提取細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行目的基因的擴增。TNF-α引物上游：5’-TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC-3’，下游：5’-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3’；IL-6引物上游：5’-TGTGCAATGGCAATTCTGAT-3’，下游：5’-GGTACTCCAG AAGACCAGAGGA-3’；α-SMA引物上游：5’-GCACAGCTTCT CCTTGATGTC-3’，下游：5’-CCGAGATCTCACCGACCT-3’；E-cadherin引物上游：5’-AAACCTGATGGATGTGGGATG-3’，下游：5’-GGTTTTCCCAGTCACGACGTTG-3’；以GAPDH作為內參，引物上游：5’-AACGACCCCTTCATTGACCT-3’，下游：5’-CACCAGTAGACTCCACGACA-3’。反應條件：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃60 s，40個循環，各設置3個重復孔，結果以2-△△Ct方法分析細胞基因表達差異。

1.2.6 Western blot檢測肺組織中α-SMA和E-cadherin的蛋白表達水平：提取肺組織剪碎后放入液氮進行研磨，加入500 μL蛋白裂解液繼續研磨，離心取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。加樣，經電泳蛋白分離和轉膜，于5%脫脂奶粉封閉30 min。一抗孵育（1:1 000），4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。再用二抗（1:5 000）常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用凝膠成像系統顯色曝光，經Quantity One進行灰度測量分析。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS20.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色評估博來霉素誘導的肺纖維化小鼠模型肺組織病理改變 HE染色結果發現，博來霉素誘導的肺纖維化模型組小鼠肺組織肺泡滲出物減少，肺泡結構被破壞；間質間隙明顯擴大，細胞外基質增生明顯；在肺間質中也觀察到成纖維細胞增殖，并且膠原纖維的積聚形成了廣泛的纖維化。與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織肺泡腔和肺間質中可見炎性細胞浸潤，肺間隔增厚，肺間質中可見少量膠原纖維結構。見圖1。

圖1 2組小鼠肺組織病理形態改變（HE，×200）

2.2 2組肺組織氧化應激水平及炎癥因子表達 氧化應激檢測結果發現，與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織SOD活性顯著升高（P＜0.05）；與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織MDA表達量顯著降低（P＜0.05）。RT-PCR結果發現，與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 mRNA表達量顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 2組肺組織氧化應激水平及炎癥因子表達（n=15，±s）

表1 2組肺組織氧化應激水平及炎癥因子表達（n=15，±s）

與模型組比：aP＜0.05

組別 SOD（U/mg） MDA（nmol/g） TNF-α mRNA IL-6 mRNA模型組 7.30±0.80 441.1±13.7 2.78±0.86 3.56±1.24褪黑素組 13.90±1.00a 252.6± 9.7a 1.43±0.27a 1.06±0.38a

2.3 肺組織中α-SMA和E-cadherin mRNA和蛋白的表達水平 RT-PCR結果發現，與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織α-SMA mRNA表達量顯著降低（P＜0.05），E-cadherin mRNA表達量顯著升高（P＜0.05），見表2。Western blot結果發現，與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織α-SMA蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），見圖2。

2.4 褪黑素降低肺纖維化肺組織中α-SMA和增加E-cadherin表達 α-SMA蛋白主要分布在肺間質基質和成纖維細胞中，E-cadherin蛋白主要分布在肺泡上皮細胞。免疫組織化學染色觀察結果發現，與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織α-SMA蛋白表達量顯著降低，E-cadherin蛋白表達量顯著升高，見圖3。

表2 2組肺組織中α-SMA和E-cadherin mRNA的表達水平（n=15，±s）

表2 2組肺組織中α-SMA和E-cadherin mRNA的表達水平（n=15，±s）

與模型組比：aP＜0.05

組別 α-SMA E-cadherin模型組 1.34±0.21 0.83±0.12褪黑素組 1.03±0.15a 1.13±0.19a

3 討論

肺纖維化是以纖維化病灶和炎癥浸潤為特征的致命性肺部疾病。纖維化可發生在氣道壁上，如哮喘中較大的氣道和慢性阻塞性肺疾病小氣道周圍或肺實質[8]，會導致肺實質瘢痕形成和肺功能逐漸下降，最終導致呼吸衰竭[9]。闡明纖維化的發生和發展的分子機制和過程，有助于開發新的有效治療方法。

圖2 Western blot檢測α-SMA、E-cadherin蛋白表達

圖3 免疫組織化學檢測α-SMA和E-cadherin蛋白表達（×200）

氧化應激被認為是參與肺纖維化進展的重要分子機制[10]。已有相關研究表明肺纖維化和炎癥因子反應緊密相關[11]。IL-6水平降低可以使小鼠肺纖維化減弱[12]。TNF-α可以誘導NF-κB激活促進肌成纖維細胞分化，促進肺纖維化進展[13]。CHEN等[14]的研究報道龍膽苦苷能抑制炎癥和纖維蛋白形成的過程，改善博來霉素誘導的小鼠肺纖維化。褪黑素主要由松果體在夜間合成并分泌[15]，是一種不依賴受體的自由基清除劑，具有強效的抗氧化和抗炎特性[16]。ZHAO等[17]研究表明褪黑素通過減輕內質網應激，降低內質網應激介導的上皮-間質轉化，從而減輕博來霉素誘導的肺纖維化。KARIMFAR等[18]研究報道褪黑素可以通過抑制環氧合酶-2的表達，減弱博來霉素誘導的肺纖維化。與上述文獻報道相一致，本研究發現褪黑素可以使肺纖維化組織SOD表達量顯著升高，MDA表達量顯著降低，降低肺纖維化組織TNF-α、IL-6表達量，抑制肺纖維化小鼠氧化應激和炎癥因子水平。

纖維增殖性疾病的特征在于α-SMA的表達量增加[19]，E-cadherin是上皮細胞黏附和表型的主要標志，其減少和丟失是上皮-間質轉化的標志，進而導致纖維化形成[20]。博來霉素是臨床上一種有效的抗癌藥物，主要用于治療生殖細胞瘤和淋巴瘤，但是其通過誘導肺組織氧化應激和促進炎癥反應導致肺纖維化[21]。YOU等[7]報道博來霉素腹腔注射可誘導小鼠肺纖維化。本研究HE染色結果發現，模型組小鼠肺組織肺泡滲出物減少，肺泡結構被破壞；此外，間質間隙明顯擴大，細胞外基質增生明顯。與模型組比，褪黑素組小鼠肺組織肺泡腔和肺間質中可見炎性細胞浸潤，肺間隔增厚，肺間質中可見少量膠原纖維結構，提示博來霉素成功誘導小鼠肺纖維化，褪黑素可以抑制肺纖維化進展。進一步通過免疫組織化學、RT-PCR以及Western blot實驗結果發現，褪黑素抑制α-SMA mRNA和蛋白表達，促進E-cadherin mRNA和蛋白表達。提示褪黑素可以通過調控α-SMA和E-cadherin表達抑制肺纖維化進展。

綜上所述，褪黑素通過降低氧化應激和炎癥因子水平，抑制α-SMA蛋白表達，促進E-cadherin蛋白表達，延緩肺纖維化進展。