烏司他丁對呼吸機相關性肺炎模型大鼠腸道通透性及細菌移位的影響

王瑞明

作者單位：杭州市中醫院急診科（杭州 310007）

腸道是人體最大的細菌庫[1]，腸道黏膜是抵御細菌入侵的重要屏障且極易受損傷。危重患者由于缺氧、感染、應激等各種刺激使腸道屏障改變，通透性增高，腸道免疫功能抑制，腸內細菌和毒素移位，參與多器官功能障礙綜合癥（MODS）的發病。研究[2]表明，谷氨酰胺是腸道黏膜的重要能源物質，有保持腸黏膜完整性的作用。烏司他丁可以有效抑制炎癥介質釋放，保護重要臟器。本研究就烏司他丁及谷氨酰胺對呼吸機相關性肺炎（VAP）大鼠腸黏膜屏障及細菌移位進行探討。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠100只，體質量280～320g，由浙江中醫藥大學動物房提供，合格證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 實驗設備 光學顯微鏡（Olympus日本），石蠟切片機（RM2135型 德國），低溫高速離心機（Beckman德國），SX-300S凝膠圖像分析處理系統（上海小源科技有限公司），高效液相色譜儀（美國water公司），精密電子天平（Sartorius公司），電泳儀（Bio-RAD公司），代謝籠等。

1.3 實驗藥品與試劑 烏司他丁（廣東天普生化醫藥股份有限公司，批號H20040476）、谷氨酰胺（辰欣藥業股份有限公司，批號H20053877）、乳果糖標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號6300817E7）和甘露醇標準品（國藥集團化學試劑有限公司，批號S11049）。

2 實驗方法

2.1 大鼠呼吸機相關性肺炎（VAP）模型建立[3]（1）經口氣管插管：用16和18號靜脈套管針制備氣管導管。大鼠麻醉前禁食12h，用20%的烏拉坦腹腔注射麻醉，用消毒小紗布將舌向左外側上方輕輕拉出，頭部盡量向上抬起，同時上下頜分開。在額戴式喉鏡反射光照射下對準聲門旋轉插入自制氣管導管，插入深度為套管針尾部與牙齒平齊。觀察棉絮在氣管導管口的起伏并用聽診器聽雙肺呼吸音以確定導管在氣管內，將氣管導管外層與大鼠上唇縫合固定，連接動物呼吸機控制呼吸。呼吸機參數設定為：潮氣量（V）12mL/kg，呼吸頻率 70 次/min，吸入氧濃度（FiO2）100%。為防止體位引起的肺不張，每隔30min行2～3次大V通氣。股靜脈插管，以3～5mL/h輸入5%的葡萄糖鹽水。（2）大鼠VAP模型制備：每只大鼠機械通氣24h（無需使用肌松劑）后，豎起固定板＞45度，以微量注射器快速注入0.2mL 3×108cfu/L銅綠假單胞菌（PA）菌液和0.55mL氣體，并保持體位5min。造模成功標準[3]：出現肺炎臨床表現；肉眼觀察大鼠肺葉可見不同程度的融合性出血性病灶；光鏡下觀察大鼠肺組織呈小葉性肺炎特征；外周血和肺泡灌洗液（BALF）細菌學培養陽性。

2.2 給藥方法 將100只SD大鼠隨機分為空白對

2.4 統計學方法 應用SPSS17.0軟件統計，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析及Dunnett’s法進行兩兩比較。計量資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠腸道通透性（尿液L/M）比較 術后第5天24h尿液L/M五組比較差異有統計學意義（F=19.41，P＜0.01）。進一步兩兩比較，模型組 L/M 高于空白對照組（P＜0.01），其余三組則與空白對照組相似，但均低于模型組（P均＜0.01），見表1。照組、模型組、烏司他丁組、谷氨酰胺組、烏司他丁聯合谷氨酰胺組，每組20只。除空白對照組外，其余各組大鼠均建立VAP模型，模型組、空白對照組大鼠予生理鹽水靜脈注射2mL/d。其余各組分別給予烏司他丁10萬U/kg靜脈注射2mL/d、谷氨酰胺0.75g/kg靜脈注射2mL/d、烏司他丁加谷氨酰胺（劑量同上），連續給藥5天。

2.3 檢測項目 （1）腸道通透性：給藥后第5天，各組大鼠經口灌胃乳果糖+甘露醇混合液2mL，轉代謝籠收集24h尿液。取10mL尿液加硫柳汞2mL置 -20℃冰箱保存。用HS色譜工作站對色譜圖形進行積分處理。根據標準曲線計算公式算出標本中甘露醇及乳果糖濃度，從而計算得出乳果糖/甘露醇腸道通透性（L/M）。（2）腸系膜淋巴結培養：給藥后第6天處死大鼠，在無菌條件下取數枚腸系膜根部淋巴結，經碾磨后置37℃培養箱孵育48h后鑒定菌種及統計菌落計數。菌落數超過100/g組織為細菌移位陽性。

表1 各組大鼠腸道通透性（尿液L/M）比較（±s）

表1 各組大鼠腸道通透性（尿液L/M）比較（±s）

注：與空白對照組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01；L/M：乳果糖/甘露醇

組別空白對照組模型組烏司他丁組谷氨酰胺組烏司他丁聯合谷氨酰胺組鼠數20 20 20 20 20 L/M 0.1592±0.0621 0.4496±0.1880△0.2622±0.0965*0.2490±0.0846*0.2193±0.0745*

3.2 各組大鼠細菌培養陽性率比較 模型組陽性率明顯高于空白對照組（P＜0.01），其余三組均低于模型組（P均＜0.01）。培養結果主要為大腸桿菌為主的腸道寄生菌細菌，見表2、圖1（插頁）。

4 討論

呼吸機相關性肺炎（VAP）是指應用機械通氣治療后48h和停用機械通氣拔除人工氣道48h內發生的肺實質的感染性炎癥。呼吸機相關性肺炎的病因和發病機制較多，其中呼吸機相關性肺炎與腸道功能關系非常密切。腸道是機體最大細菌和毒素庫，由于禁食等多種原因導致腸道菌群失調，屏障功能破壞，有可能成為VAP患者菌血癥來源。腸道菌群的移位及腸黏膜的屏障作用與呼吸機相關性肺炎關系密切。

表2 各組大鼠細菌培養陽性率比較（%）

腸黏膜通透性增高是腸屏障功能受損的重要表現[4]，黏膜通透性增高出現在腸黏膜形態學出現改變之前。因此，通過檢測腸黏膜通透性可以反映腸黏膜屏障功能，尿L/M比值可以有效反映腸道通透性的改變[5]。谷氨酰胺作為人體內重要的自由氨基酸之一，在維持腸道完整性和維持人體多種生理代謝方面起著重要的作用[6-7]。谷氨酰胺對危重患者的腸道保護作用已初步得到肯定[8]，它可以減輕腸屏障損害，防止腸源性感染[9-10]，抑制小腸黏膜萎縮[11]。烏司他丁具有很強的水解酶抑制作用，有抑制炎癥介質的釋放作用[12]。本研究顯示，腸道通透性方面，與空白對照組比較，模型組L/M明顯增大（P＜0.01），其余三組則與空白對照組相似，谷氨酰胺組L/M小于烏司他丁組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。細菌移位方面，模型組陽性率明顯高于空白對照組（P＜0.01），其余三組低于模型組（P＜0.01），培養結果主要為大腸桿菌為主的腸道寄生菌。烏司他丁及谷氨酰胺對VAP腸道黏膜的通透性及防止腸道菌群移位有一定的作用。