益氣養陰活血方對高糖誘導的NRK-52E細胞代謝記憶的影響

章文星 杜月光 柴可夫

作者單位：浙江中醫藥大學基礎醫學院（杭州 310053）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）最常見的并發癥之一。研究[1-2]顯示，糖脂代謝紊亂在DN發病過程中起著重要作用，同時長期的代謝紊亂通過改變表觀遺傳修飾，激活持續的炎癥反應，形成代謝記憶，從而造成血管損傷，引起血管并發癥。而代謝記憶可能與DM患者瘀血的形成有關。中醫認為，糖尿病屬“消渴”范疇，主要病變臟腑在肺、胃、腎，其中腎臟最為關鍵，尤其多見腎陰不足。隨著病情的發展，久病入絡，瘀血阻滯，臨床中久病的消渴患者常有肢體麻木，靜脈曲張，甚至中風偏癱等血脈瘀滯表現。益氣養陰活血方是根據臨床消渴患者常氣陰不足兼瘀血阻滯的病機而形成的一張經驗方，由黃芪、女貞子、葛根、丹參、制大黃等組成，臨床研究及動物實驗顯示，該方治療早期糖尿病腎病效果較好。本實驗通過腎小管上皮細胞體外培養方式，從轉錄共激活因子P300（P300）、沉默調節因子 1（SIRT1）的 mRNA 表達水平，探討益氣養陰活血方干預及預防代謝記憶的作用機制。

1 材料

1.1 主要試劑和儀器 1g/L DMEM培養基，批號C11885500BT；胎牛血清（GIBCO），批號 1715752；scriptTMgDNAClear cDNASynthesis Kit試劑盒（BIORAD），批號 1725035；噻唑藍（MTT）試劑盒（碧云天），批號 030917170511；α-平滑肌激動蛋白（α-SMA）抗體（Abcam），批號 ab21027；E-鈣黏蛋白（ECadherin）抗體（Abcam），批號 ab76055；益氣養陰活血方（黃芪、靈芝、女貞子、葛根、丹參、制大黃）（浙江中醫藥大學中醫門診部提供）。

1.2 益氣養陰活血方含藥血清制備 8周齡，體質量250～300g的純種雄性SD大鼠20只（浙江中醫藥大學實驗動物中心提供），生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016，使用許可證號：SYXK（浙）2013-0184，在SPF狀態下普通飼料適應性喂養1周后，按體質量分層將大鼠隨機分成含藥血清組10只，正常對照組10只。含藥血清組予益氣養陰活血方（組成：黃芪20g，靈芝、女貞子各 10g，葛根、丹參各 20g，制大黃5g，共計85g生藥。加5倍量水浸泡2h，煎煮1h，過濾藥液，濾渣另加3倍量水煎煮1h，過濾藥液，二次水煎劑混合后，濃縮成0.8g/mL）水煎劑灌服。通過體表面積換算大鼠每日灌藥劑量為0.85mL/100g（6.8g生藥/kg），每天9:00及15:00各灌胃1次，連續3天。正常對照組予生理鹽水灌服。末次灌胃1h后處死大鼠，收集血清，-20℃凍存待用。

1.3 大鼠腎小管上皮細胞培養 正常大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E細胞）[中國科學院上海生命科學研究院細胞庫（SIBS）]。NRK-52E細胞常規培養于含10%胎牛血清1g/L葡萄糖濃度DMEM培養基中，顯微鏡下觀察貼壁融合率達80%～90%時，以胰蛋白酶消化，制成細胞懸浮液進行傳代、培養。

2 方法

2.1 細胞毒性檢測 在96孔培養板中每孔接種1×104個細胞，含10%胎牛血清1g/L DMEM培養基37℃溫育箱培養，顯微鏡下觀察完全貼壁后開始實驗培養。每組設置6個副孔，每孔加入200μL含10%胎牛血清的 30、35、40、50、60、70mmol/L 的高糖DMEM培養基，培養48h。培養終止后，去除原溶液，按組每孔加入100μL，葡萄糖低糖組加入含1g/L濃度葡萄糖的DMEM培養基，每孔加入MTT溶液10μL，37℃溫育箱避光孵育4h。凋零孔組不加細胞培養，處理同低糖組。終止后每孔加入100μL Formanzan溶液，37℃溫育箱避光繼續孵育4h，在酶聯免疫檢測儀570nm測定吸光度，計算出抑制率，抑制率=（低糖組平均OD值-高糖組平均OD值/低糖組平均OD值-凋零孔OD值）×100%。抑制率最高且值≥50%為最佳制備高糖細胞模型濃度。

2.2 實驗分組 根據細胞毒性實驗檢測結果，選取適宜的制備模型的高糖濃度，進行以下實驗分組：低糖組予64h低糖，高糖組予64h高糖，短暫高糖組予16h高糖+48h低糖，高糖+中藥血清治療組予16h高糖+48h含中藥血清高糖，短暫高糖+中藥血清治療組予16h高糖+48h含中藥血清低糖。低糖組葡萄糖濃度為1g/L。各組均加入含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養。

2.3 免疫組化法檢測NRK-52E細胞α-SMA和ECadherin表達 將無菌的小圓片置于6孔板中，每組3個副孔，計數后每孔接種1.6×105個細胞，加常規培養基37℃溫育箱培養24h，然后按2.2的方法置于37℃溫育箱進行培養。培養終止后，PBS清洗，福爾馬林固定，按試劑盒說明書加入一抗稀釋液，4℃冰箱過夜。PBS清洗，加入二抗稀釋液，進行DAB顯色，蒸餾水終止反應，蘇木素染色，脫水，透明，封片。檢測α-SMA和E-Cadherin的表達。

2.4 RT-PCR法檢測P300、SIRT1 mRNA表達 細胞培養同上。Trizol法提取RNA。測量OD 260/280值，值在1.8～2.0符合要求。按照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，獲得cDNA進行PCR擴增。PCR引物序列，見表1。

表1 PCR引物序列

2.5 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間計量資料應用t檢驗，多組間計量資料采用方差分析，組間比較采用SNK檢驗，不符合正態分布的資料采用非參數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組MTT OD值及抑制率結果比較 高糖濃

PCR擴增反應條件：預變性階段溫度及時間：50℃ 2min，95℃ 10min；擴增階段溫度及時間：95℃15s，60℃ 60s，95℃ 30s，共 40 個循環；后延伸階段溫度及時間：95℃ 30s，60℃ 15s。采用 2-Δct表示基因相對水平。度為60mmol/L時抑制率最高，是最佳制備高糖模型的濃度。見圖1（封三）。

3.2 各組NRK-52E細胞α-SMA、E-Cadherin表達情況比較 高糖刺激后，NRK-52E細胞α-SMA表達顯著升高，E-Cadherin隨著高糖刺激時間增加表達逐漸降低。高糖刺激16h后改為低糖培養，α-SMA表達較正常組仍有明顯升高，E-Cadherin表達較正常組略微減少。中藥血清干預后，α-SMA表達減弱，高糖刺激時間越短，干預效果越明顯，中藥血清干預后E-Cadherin表達明顯增加。見圖2、3（封三）。

圖1 各組MTT OD值及抑制率結果比較

圖2 各組NRK-52E細胞α-SMA表達情況比較（Envision染色 ×200）

圖3 各組NRK-52E細胞E-Cadherin表達情況比較（Envision染色 ×200）

圖4 各組P300、SIRT1 mRNA表達比較

3.3 各組P300、SIRT1 mRNA表達比較 高糖刺激導致SIRT1 mRNA表達相對降低，P300 mRNA表達相對增加，與低糖組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。高糖組與短暫高糖組比較，SIRT1與P300 mRNA表達均未見明顯差異（P＞0.05）。與高糖組相比，高糖+中藥血清治療組SIRT1 mRNA表達相對增加，P300 mRNA表達相對降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與短暫高糖組相比，短暫高糖+中藥血清治療組SIRT1 mRNA表達相對增加，P300 mRNA表達相對降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。高糖+中藥血清治療組、短暫高糖+中藥血清治療組比較，SIRT1與P300 mRNA表達均未見明顯差異（P＞0.05）。見圖 4（封四）。

4 討論

隨著我國人民生活水平大幅度提高，DM的發病率明顯上升，尤其是2型糖尿病的發病率大大增加[3]。糖尿病腎?。―N）是糖尿病最為常見，也是主要的微血管并發癥之一。臨床上早期高血糖引起的血管損傷在血糖控制到正常水平后仍繼續存在，并且可導致后期血管的病變，這一現象即稱之為“代謝記憶”[4]，表觀遺傳[5]可通過修飾及調節基因的表達來改變代謝記憶。DM由于長期的糖脂代謝紊亂，激活了持續的炎癥反應，促使腎小管上皮細胞氧化損傷和凋亡，最終引起腎間質細胞纖維化（tubular interstitial fibrosis，TIF）。高血糖下受損細胞可招募炎癥介質，促進炎癥基因轉錄，發生表觀遺傳。本實驗在臨床研究及動物實驗取得明確療效的前提下[6-7]，運用血清藥理學，從細胞實驗角度，通過高糖培養模擬代謝記憶，從表觀遺傳著手，探討益氣養陰活血湯對DN防治的部分作用機制。

上皮-間充質轉化（epithelial-Mesenchymal transition，EMT）是TIF重要的發病機制之一，其中間充質細胞標志物α-SMA，上皮細胞標志蛋白E-carherin是腎小管上皮細胞纖維化的重要觀察指標之一，在EMT過程中可表現為E-carherin的表達丟失及α-SMA的表達。本實驗顯示，在高糖刺激下，α-SMA表達較低糖組明顯增加，提示出現轉分化現象，同時細胞間質間緊密連接減弱，黏附分子E-carherin表達受抑制。細胞在高糖刺激16h后改為低糖培養，α-SMA表達較正常組仍有明顯升高，E-Cadherin表達較正常組略微減少，提示細胞在高糖刺激后改為低糖正常培養后仍存在轉分化現象。中藥血清干預后，α-SMA表達減弱，E-carherin表達顯著增強。結果顯示益氣養陰活血方對NRK-52E細胞纖維化有治療作用。

轉錄共激活因子P300是一種重要的組蛋白乙?；福聊畔⒄{節子SIRT1是一種重要的組蛋白去乙酰化酶，組蛋白乙酰化修飾在表觀遺傳修飾中起重要作用[8]。RT-PCR結果顯示，高糖組P300 mRNA表達較低糖組升高（P＜0.05），SIRT1 mRNA表達較低糖組下降（P＜0.05），但高糖組與短暫高糖組比較，SIRT1與P300 mRNA表達均未見明顯差異（P＞0.05），提示短暫的高糖刺激，即可造成細胞的損傷，并且在短暫的高糖刺激后改低糖繼續培養48h后仍存在轉分化現象，可能存在對早期代謝狀態的記憶效應[9]。在中藥血清干預后，高糖+中藥血清治療組P300 mRNA表達較高糖組下降（P＜0.05），SIRT1 mRNA表達較高糖組上升（P＜0.05）。短暫高糖+中藥血清治療組P300 mRNA表達較短暫高糖組下降（P＜0.05），SIRT1 mRNA 表達較短暫高糖組上升（P＜0.05）。高糖+中藥血清治療組與短暫高糖+中藥血清治療組比較，SIRT1與P300 mRNA表達均無統計學意義（P＞0.05）。結果顯示益氣養陰活血方可能同時通過抑制P300，刺激SIRT1表達進行一個雙向調節，從而延緩纖維化的發生發展。

本實驗結果顯示，益氣養陰活血方含藥血清干預后NRK-52E細胞P300表達下調，SIRT1表達上升調，同時α-SMA表達下調，E-carherin表達上調，提示益氣養陰活血方可能抑制P300，同時刺激SIRT1表達，通過組蛋白乙?；揎椀母淖儊硪种蒲装Y相關基因轉錄[10]，減輕細胞凋亡及腎損傷。