黃芩素對順鉑抗宮頸癌作用影響的實驗研究

吳三英 譚曉霞 毛其芬

作者單位：1浙江省麗水市婦幼保健院檢驗科（麗水 323000）；2浙江省立同德醫院檢驗科（杭州 310012）

宮頸癌是發病率很高的婦科腫瘤，好發于40歲以下女性，手術和化療目前仍是治療宮頸癌的主要手段[1]。順鉑是一種廣譜抗腫瘤化療藥物，對肺癌、結腸癌和宮頸癌等多種腫瘤都有療效[2-3]。然而大劑量順鉑的副反應大，特別是耳毒性和腎毒性不容忽視[4-5]。本文探討黃芩素對順鉑抗宮頸癌作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料 DMEM培養基（批號12491）購于美國Gibco公司。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（批號APOAF）、噻唑藍（MTT，批號 M2128）、黃芩素（批號275667）和順鉑（批號 2210000）購于美國 Sigma-Aldrich。長壽因子 1（SIRT1）抗體（批號 2493）、p53 抗體（批號 2527）、乙酰化 p53抗體（批號 2525）、p53上調凋亡調節因子（Puma）抗體（批號12450）、活化型半胱天冬酶3（caspase-3）（批號39661）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號5174）購于美國Cell Signaling公司。增強型化學發光底物（ECL）試劑盒（批號 32106）購于美國 Pierce。脂質體 2000（批號11668019）購于美國 Invitrogen。

1.2 細胞培養 人宮頸癌細胞系Hela購于美國模式培養物典藏所（ATCC）。細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養于37°C恒溫培養箱中并通入5%CO2。

1.3 SIRT1質粒構建和轉染 人SIRT1基因的開放閱讀框架序列經PCR擴增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成SIRT1重組過表達質粒。SIRT1過表達質粒用脂質體2000按試劑操作說明書步驟進行轉染，簡要步驟如下：將2μg/mL質粒用脂質體2000進行包裹后將其加入到無血清培養基進行混合。將貼壁的Hela細胞置于該無血清培養基孵育6h后棄去無血清培養基并加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養基培養24h。

1.4 細胞活力檢測 將質粒轉染后的Hela細胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組、黃芩素組、順鉑組、順鉑+黃芩素組和順鉑+黃芩素+SIRT1質粒組。對照組為空質粒轉染的Hela細胞不加藥物培養48h，順鉑組為在空質粒轉染的Hela細胞中加入2μmol/L的順鉑培養48h，黃芩素組為在空質粒轉染的Hela細胞中加入10μmol/L的黃芩素培養48h，順鉑+黃芩素組為在空質粒轉染的Hela細胞中加入2μmol/L的順鉑和10μmol/L的黃芩素培養48h，順鉑+黃芩素+SIRT1質粒組為在SIRT1質粒轉染的Hela細胞中加入2μmol/L順鉑和10μmol/L黃芩素培養48h。藥物處理完畢后在Hela培養孔中加入20μL 5mg/mL MTT再培養4h，小心吸去上清液，孔中加入150μL二甲亞砜，充分震蕩后在570nm波長下用酶標儀檢測OD值。Hela細胞活力抑制率計算公式：抑制率=（對照組OD-藥物處理組OD）/對照組OD×100%。

1.5 細胞凋亡實驗 將質粒轉染后的Hela細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按1.4進行分組處理。處理完畢后按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書用Annexin-V對細胞進行染色孵育20min。之后采用流式細胞術檢測Hela細胞的凋亡，凋亡誘導率用Annexin-V陽性細胞數占總細胞數的百分比表示。

1.6 Western blot實驗 將質粒轉染后的Hela細胞按2×106/孔接種在6孔板上，按1.4進行分組處理。藥物處理完畢后將細胞用蛋白提取液提取總蛋白質。之后將提取的總蛋白質用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到醋酸纖維素膜上，用SIRT1抗體、p53抗體、乙酰化p53抗體、Puma抗體、活化型半胱天冬酶3和GAPDH抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。

1.7 統計學方法 實驗重復3次，實驗數據用均數±標準差（±s） ，應用SPSS15.0統計分析軟件進行處理，組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組Hela細胞細胞活力抑制率、凋亡誘導率比較 MTT和流式細胞實驗結果顯示，順鉑+黃芩素組Hela細胞細胞活力抑制率和凋亡誘導率均顯著高于順鉑組和黃芩素組（P＜0.05），見表 1。

表1 各組Hela細胞細胞活力抑制率和凋亡誘導率比較（%，±s）

表1 各組Hela細胞細胞活力抑制率和凋亡誘導率比較（%，±s）

注：與順鉑組比較，*P＜0.05；與黃芩素組比較，△P＜0.05；與順鉑+黃芩素組比較，▲P＜0.05

組別對照組順鉑組黃芩素組順鉑+黃芩素組順鉑+黃芩素+SIRT1質粒組孔數3 3 3 3 3細胞活力抑制率0 18.1±1.4 5.8±0.5 66.3±5.7*△25.7±2.1▲凋亡誘導率1.6±0.2 10.4±0.9 2.8±0.3 38.4±3.2*△14.5±1.1▲

2.2 黃芩素通過下調Hela細胞SIRT1表達水平提高其對順鉑治療的敏感性 Western blot實驗結果顯示，黃芩素處理能明顯抑制Hela細胞SIRT1表達水平，而順鉑處理對SIRT1表達水平無影響，見圖1（插頁）。為了探討黃芩素發揮順鉑增效作用的機制是否和SIRT1的下調有關，筆者在Hela細胞中轉染SIRT1質粒使SIRT1蛋白強制高表達。實驗結果顯示，黃芩素和順鉑聯合能顯著降低轉染SIRT1質粒的Hela細胞細胞活力抑制率和凋亡誘導率（P＜0.05），見表1。

2.3 黃芩素通過SIRT1/p53途徑增強順鉑對Hela細胞的殺傷活性 Western blot實驗結果顯示，順鉑處理能誘導Hela細胞p53的表達和乙酰化水平，而黃芩素單獨處理雖不能直接誘導p53的活化，但能明顯促進順鉑誘導的p53的乙酰化和表達水平的增加。然而轉染SIRT1表達質粒后，黃芩素對順鉑誘導的p53的促進作用受到明顯抑制，見圖2（插頁），表明黃芩素通過下調SIRT1的表達促進順鉑誘導的p53的乙酰化和表達水平的增加。另外，Hela細胞p53下游蛋白Puma在黃芩素和順鉑的聯合作用下，表達水平顯著提高，同時，黃芩素聯合順鉑能顯著誘導Hela細胞凋亡執行分子caspase-3的活化，而轉染SIRT1質粒后，Puma蛋白表達和caspase-3的活化均受到顯著抑制，見圖3（插頁）。

3 討論

黃芩素是從天然藥物黃芩根部提取的主要活性成分，具有抗過敏、抗菌、抗病毒的功效，近期研究還發現黃芩素具有一定的腫瘤抑制作用[6]，本研究發現，黃芩素聯合處理能顯著提高宮頸癌細胞在順鉑治療下的細胞活力抑制率和凋亡誘導率（P＜0.05），表明黃芩素能作為一種輔助治療藥物增強順鉑對宮頸癌細胞的殺傷活性，降低順鉑的使用劑量。

SIRT1是一種組蛋白去乙酰化酶，在結直腸癌、乳腺癌、肝癌和宮頸癌等多種腫瘤細胞中發生過表達[7-10]。腫瘤細胞中的SIRT1能使p53、p73和FOXO等轉錄因子發生去乙酰化而使它們失去活性，從而抑制促凋亡蛋白表達對抗化療藥物誘導的凋亡[11-13]，因此SIRT1是提高腫瘤細胞化療敏感性的潛在靶點。在SIRT1依賴的抗凋亡通路中，p53的去乙酰化發揮了重要作用。p53是細胞中一種不穩定蛋白，然而p53能在DNA發生損傷（順鉑治療）時發生乙酰化修飾，而乙酰化的p53能穩定存在并具有轉錄活性，能誘導下游Puma等促凋亡蛋白的表達而使細胞發生凋亡[14-15]。然而SIRT1的高度表達能通過減弱p53的穩定性從而保護腫瘤細胞逃避藥物誘導的凋亡信號。

本研究發現，黃芩素對順鉑協同抗宮頸癌活性依賴于細胞SIRT1的抑制。黃芩素通過抑制SIRT1表達從而減弱順鉑誘導的乙酰化p53發生去乙酰化失活，使Puma等下游促凋亡蛋白發生過表達而使宮頸癌細胞發生凋亡性死亡。