IL-22在扁平苔蘚中的表達

朱珊珊 王蘊龍 龐傳超

白介素-22(Interleukin，IL-22)是最近幾年新發現的一種CD4+Th細胞因子，由Th17和Th22為主的免疫細胞分泌產生，主要生物學功能為微生物防御、保護和修復組織損傷及急性期反應，IL-22雖由這些細胞產生，卻不作用于它們，在皮膚主要特征性的作用于角質形成細胞，其獨特的免疫介導形式使其在很多炎癥性、自身免疫性、腫瘤性皮膚病中發揮重要作用。扁平苔蘚是一種臨床上比較常見的累及皮膚黏膜的瘙癢性慢性炎癥性疾病，病因尚未完全明確，可能是由遺傳、感染、藥物、自身免疫、慢性病灶、精神神經、內分泌與代謝障礙等相互作用導致的[1]，多數支持多因素影響的T細胞介導的針對基底細胞的免疫反應。目前關于IL-22在扁平苔蘚中的作用研究較少，本文研究IL-22在扁平苔蘚皮損中的表達，并以正常皮膚作為對照，以探討其在疾病中的可能意義，為扁平苔蘚的診斷和治療開辟新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 實驗組30例：為2016年1～11月在吉林大學第二醫院皮膚科經臨床和病理檢查確診為扁平苔蘚患者的病變皮膚，其中男18例，女12例，年齡為19～63歲，平均年齡(42.3±8.4)歲。所有實驗組病變的特點是具有相似程度的炎癥反應，且無本病以外的糖尿病、高血壓、感染性和過敏性疾病或其他自身免疫性疾病，如銀屑病、類風濕關節炎、紅斑狼瘡等，且近3個月未系統或局部應用免疫抑制劑、糖皮質激素、抗生素等藥物。對照組10例為2016年1～11月在吉林大學第二醫院皮膚外科手術切除的正常皮膚，其中男5例，女5例，年齡為22～66歲，平均年齡(45.6±7.3)歲。所有對照組均無免疫系統疾病，無皮膚感染，兩組對象年齡、性別相匹配。

1.2 主要試劑 兔抗人IL-22多克隆抗體、兔抗體免疫組化試劑盒、DAB顯色液均來自北京欣博盛生物科技有限公司。檸檬酸鈉抗原修復液來自碧云天生物科技有限公司。

1.3 免疫組化檢測 將切除的組織標本放入4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋備用，將包埋的組織切片4 μM厚度，用于HE和免疫組化染色觀察。免疫組化染色(SABC法)按照欣博盛提供的兔抗體免疫組化試劑盒的說明進行，遵循每批染色以已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為空白對照。

1.4 結果判定 以細胞質中棕黃色顆粒狀染色為陽性標準，由2位具有獨立判斷能力的醫師采用雙盲法對實驗結果進行判定。在光鏡下計數，40×10倍視野下，于每個組織片內隨機選取5個視野，用5 mm×5 mm網格目鏡微尺分別計算陽性細胞數及觀察的細胞總數，取其平均值，計算陽性細胞數占細胞總數的百分率，根據染色強度以及著色范圍進行半定量評分，結果分析方法根據Shimizu[2]法改良而成。染色強度用0～3級評分:0分為無染色，1分為輕度染色，2分為中度染色，3分為強染色；著色范圍采用陽性細胞數占細胞總數的百分率計分，用0～3級評分：<20%為0分，20%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分。以上兩項相加為著色程度積分，表示IL-22在皮損中的表達強弱，結果:0、1分為陰性(-)；2分為弱陽性(+)；3～4分為陽性(++)；5～6分為強陽性(+++)。

1.5 統計學方法 用SPSS 17.0統計軟件處理數據，采用兩等級資料比較的Mann-Whitney U秩和檢驗進行相關分析，結果以P<0.05為有統計學差異，P<0.01為有統計學顯著性差異。

2 結果

2.1 HE染色結果 見圖1。

2.2 免疫組化染色結果 見圖2、3，表1。在30例實驗組中，IL-22主要表達于扁平苔蘚表皮全層的角質形成細胞和真皮淺層浸潤的淋巴細胞胞質中，呈棕黃色顆粒。其中16例為強陽性，8例為陽性，4例為弱陽性，2例為陰性。在10例對照組中，IL-22也表達于正常皮膚組織，主要定位于基底層附近的角質形成細胞中，呈淡黃色顆粒。其中1例為強陽性，2例為陽性，4例為弱陽性，3例為陰性。由表1可看出，IL-22在扁平苔蘚皮損中的表達水平明顯高于在正常皮膚組織中的表達水平，二者差異經統計學分析具有顯著統計學意義(P<0.01)。

圖1 a:表皮角化過度，顆粒層楔形增厚，棘層不規則增厚;b:基底細胞液化變性，真皮淺層致密淋巴細胞帶狀浸潤(a HE，×100；b HE，×200)

圖2 IL-22在扁平苔蘚中的表達(2a,2c SABC，×100；2b,2d SABC，×400)

圖3 IL-22在正常皮膚中的表達(3a SABC×100；3b SABC×400)

表1 IL-22在扁平苔蘚和正常皮膚組織中的表達

注：采用Mann-Whitney U test，P<0.01為有顯著性統計學差異

3 討論

扁平苔蘚是一種臨床上比較常見的特發性炎癥性疾病，占皮膚科所有就診患者的0.5%以上[3]，皮損部位不一，可同時或先后累及一個或多個區域，皮膚和口腔黏膜是最常受累的部位。目前認為免疫機制和角質形成細胞障礙活化介導了扁平苔蘚的發生，但確切的發病機制尚不清楚，IL-22是一種新型細胞因子，它在外周組織損傷期間介導著免疫細胞向上皮細胞間信號的傳遞，引起上皮細胞產生抗菌蛋白和炎癥介質。IL-22具有兩種結合受體--膜性受體(IL-22R)和可溶性受體(IL-22RA2)，膜性受體是由IL-22R1與IL-10R2構成的異源二聚體受體復合物，因細胞因子對IL-22R1具有很高的親和力，該受體的表達也決定了組織細胞對IL-22的反應性。IL-22R1的分布具有一定的組織特異性，主要表達于皮膚、腎臟、胰腺、肺臟等的實質細胞，特別是在角質形成細胞和胰腺，而在NK和單核等免疫細胞中不表達[4]。IL-22RA2是一種天然的蛋白性抑制劑，能競爭性結合IL-22并阻斷其生物學活性[5]，進而干預細胞因子下游的信號傳導。IL-22作用于角質形成細胞，誘導其產生抗炎因子或保護蛋白，如IL-11、卵泡抑素、β-防御素、鈣結合蛋白A7、A8、A9等，重塑傷口愈合，發揮固有防御機制，防止皮膚感染。另外，IL-22可以下調終末期角質形成細胞分化基因，抑制其分化產物的表達，促進細胞增殖，提高細胞向遠處遷移的能力[6]。除此之外，IL-22還能誘導多種炎癥介質的表達，即IL-6和趨化因子(CCL7、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6和CXCL8)[7]，誘導皮膚顯著增生和炎癥反應。目前人類中IL-22主要由活化的Th22、Th1、Th17細胞產生[8]，這些細胞已被證實在感染性、免疫性疾病的發生發展中均發揮著廣泛的生物活性，提示IL-22升高存在于T細胞介導的慢性炎癥性疾病如銀屑病、扁平苔蘚中。本文試驗發現在扁平苔蘚皮損部位，IL-22表達水平較正常人皮膚明顯增高(P<0.01)，提示IL-22參與了扁平苔蘚皮損的形成。

既往的研究表明，扁平苔蘚的特征在于針對上皮細胞的T細胞介導的免疫應答，引起表皮細胞損傷和真皮淺層T淋巴細胞浸潤，產生其特征性的的病理改變和臨床表現。與扁平苔蘚發病機制相關的細胞主要有CD4+T、CD8+T、樹突狀細胞、角質形成細胞，其中效應性CD4+T細胞即輔助性T細胞及其分泌的細胞因子參與了扁平苔蘚發病的各個方面。IL-22在扁平苔蘚皮損中表達明顯增多，同樣提示Th17、Th22細胞免疫參與其致病過程，這與以往的報道一致。當皮膚收到各種因素刺激時，CD4+T細胞激活，CD8+T細胞活化，將被處理過的內源性或外源性抗原信息呈遞給T細胞，釋放TNF-α、IL-22等因子。我們大膽的猜測，IL-22與受體結合后，誘導細胞內多種信號激活，進一步活化下游信號傳導通路，包括JAK/STAT通路(Jak1、Tyk2、STAT3)和MAPK通路(p38MAPK、JNK、EPKl/2)，啟動下游靶基因的表達，促進角質形成細胞增殖、抑制其凋亡和分化，誘導其產生調節防御機制的細胞因子、抗微生物肽，加強皮膚防御功能。過度表達的IL-22可能需要達到一個閾值才能引起炎癥反應，使激活的STAT3持續磷酸化，表達一系列基因產物，如Caspases、bcl-2、生存素、p53、p63，分泌血管內皮細胞生長因子等，Caspases、bcl-2、p53均為細胞凋亡標志物，激活后引起細胞凋亡，即出現凋亡小體，導致同時基底細胞液化變性，淋巴細胞凋亡缺失或減弱，可能也是炎癥細胞持續浸潤的一個原因[9]。除此之外，通過MAPK途徑激活的p38參與激活促炎分子、趨化因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等表達，亦可與TNF-α協同作用促進CSF、IL-8的釋放，誘導炎性細胞向炎癥部位游走，放大炎癥效應，形成真皮淺層T細胞帶狀浸潤，促進細胞凋亡與基底細胞液化變性。浸潤細胞繼續分泌TNF-α、IL-TIF等細胞因子，致使病情反復，病程延長。那么當IL-22在皮損區異常表達時也就可能造成扁平苔蘚特征性皮損和病理改變。本研究發現，在大多數正常表皮中也有IL-22的表達，且多位于表皮基底層，考慮可能與IL-22的正向作用相關，適量表達的IL-22可以下調終末期角質形成細胞分化基因，促進正常表皮中細胞增殖、分化，而當其過量表達時則造成皮膚顯著增生和炎癥反應等現象。IL-22在不同疾病、不同組織中扮演雙刃劍的角色，考慮可能與該細胞因子的數量、持續時間、所處環境及浸潤的炎性細胞種類等因素有關。

近年來，越來越多的學者開始研究IL-22在扁平苔蘚發病機制中的作用，但目前這些研究還不成熟，僅是初步的。Domingues等[10]對外周血單核細胞進行流式細胞儀檢測時發現，CD8+T細胞通過激活TLR7/8或SEB引起IL-22+T細胞(TC22、Th22細胞)數量頻繁增加，并能在LP患者中檢測到，這些增加可能導致IL-22分泌T細胞向皮膚或黏膜炎癥部位遷移。本次研究主要選取的對象是皮膚型扁平苔蘚皮損，目前國內外學者對白介素在扁平苔蘚中的研究多集中于口腔型，Shen等[11]通過RT-qPCR和Western blot分析檢測IL-22和靶向微小RNA的表達時進一步證實IL-22在口腔扁平苔蘚中高表達。而Chen等[12]、Weber等[13]研究時發現IL-22在口腔扁平苔蘚的表達高于皮膚型，有明顯的特異性。

扁平苔蘚皮損中T細胞的異常活化及其所產生的多種細胞因子的異常表達引發了疾病的發生，但機體通過釋放更多的因子來調節自身的免疫平衡。在本研究中，我們探討了IL-22在扁平苔蘚中的表達情況，結果提示IL-22在疾病發病中可能具有一定作用。本研究并未證實IL-22的表達與疾病嚴重程度是否呈相關性，需要血清學檢查及跟蹤患者預后等進一步觀察研究。此外，扁平苔蘚的發病過程受多因素影響，我們的實驗在取材和研究方法等諸多方面存在一定局限性，希望經過我們的研究為深入揭示扁平苔蘚發病機制提供理論依據，為疾病的治療及預后提供新的靶點。