老年抑郁癥患者芳香烴受體核轉移蛋白和神經元PAS結構域蛋白表達與認知功能的關系

張 穎 李 潔 李 剛 李 濤 梁海翔

(天津醫科大學研究生院，天津 300074)

老年抑郁癥是一組異質性疾病，通常伴有認知功能障礙。腦卒中后抑郁占老年抑郁癥患者的30%～40%〔1〕，是引發抑郁癥的主要病理因素之一。持續的抑郁狀態可引發認知功能障礙，導致患者日常生活不能自理，給家庭和社會帶來沉重負擔。海馬組織是邊緣系統的重要組成，也是學習、情感等高級認知的重要解剖學基礎〔2〕。動物實驗顯示，孤氧并行為限制的大鼠海馬組織中芳香烴受體核轉移蛋白(Arnt)2表達明顯上調、神經元PAS結構域蛋白(Npas)4表達明顯下調〔3〕，提示Arnt2和Npas4可能通過改變海馬功能進而對認知功能產生影響。本研究分析Arnt2、Npas4對老年抑郁癥患者認知功能的影響機制。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2015年6月至2016年10月天津市安定醫院老年科、神經內科、精神科住院的老年患者共173例。篩選標準：①既往無心肺衰竭、癌癥等嚴重疾病；②既往無精神類疾病史，神志清晰，能夠配合本次研究；③經患者本人或其家屬知情同意。使用漢密爾頓抑郁量表(HAMD)-24評定患者精神情況：≤20分為無抑郁，21～35分為抑郁，>35分為嚴重抑郁。本研究依據HAMD-24量表評分結合患者腦卒中病史進行分組：有腦卒中病史且評分>20分為腦卒中后抑郁組(47例)；無腦卒中病史且評分>20分為原發性抑郁組(52例)；有腦卒中病史且評分≤20分為腦卒中組(45例)；無腦卒中病史且評分≤20分為對照組(29例)。

1.2主要試劑 Trizol試劑盒、TIAN Script cDNA合成試劑盒購于上海索寶生物科技有限公司；RIPA裂解液購于無錫柏歐美地生物科技有限公司；鼠抗人Arnt2單抗隆抗體、兔抗人Npas4單抗隆抗體、GAPDH抗體購于上海康朗生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1認知功能評價 腦卒中后抑郁組、原發性抑郁組、腦卒中組患者分別于入院1 w內和2 w后進行認知功能評價。使用日本光電MEB-9200K肌電圖誘發電位儀測定，具體方法為：患者取臥位，放松全身肌肉，直視前方注意力集中，采用靶刺激和非靶刺激。其中非靶刺激規律出現，靶刺激隨機出現，患者對靶刺激進行按鍵反應，設備記錄命中率及反應時間，重復3次取均值。以對照組為參照，觀察P300的波幅及潛伏期，異常標準為超出對照組2.5個標準差。

1.3.2標本采集與處理 入選患者分別抽取空腹外周靜脈血5 ml，抗凝處理后2 000 r/min離心20 min，最上層為血漿，中間層為白細胞，下層為紅細胞。使用無菌吸管分離血漿層和白細胞層并分裝到不同離心管中，血漿放于-80℃凍存，白細胞用于提取RNA檢測mRNA和蛋白表達情況。

1.3.3熒光定量PCR檢測Arnt2、Npas4 mRNA表達情況 Trizol試劑盒提取白細胞中的總RNA，紫外分光光度法檢測濃度并計算含量，取其中5 μg逆轉錄合成cDNA。Arnt2、Npas4引物由北京創博環球生物科技有限公司設計并合成。反應體系共20 μl：cDNA 2 μl、上游和下游引物各1 μl、Sybr熒光染料7 μl、雙蒸餾水9 μl。反應條件：95℃ 5 min、95℃ 30 s、60℃ 10 s、72℃ 20 s，共40個循環。分析各條帶熒光強度，以Ct表示，以GAPDH為內參計算相對表達量。

1.3.4Western印跡檢測Arnt2、Npas4蛋白表達情況 RIPA緩沖液提取白細胞中蛋白并測定濃度，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h，室溫下分別滴加鼠抗人Arnt2單抗隆抗體(1∶1 000)、兔抗人Npas4單抗隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜；次日滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫下避光孵育2 h，曝光、顯影后用Image J分析條帶灰度值，以GAPDH為內參計算相對表達量。

1.4統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組事件相關電位P300潛伏期及波幅 與對照組相比，入院1 w內和2 w后的腦卒中后抑郁組、原發性抑郁組、腦卒中組患者P300潛伏期顯著延長，P300波幅顯著降低(P<0.05)；與原發抑郁組和腦卒中組相比，腦卒中后抑郁組P300潛伏期顯著延長，P300波幅顯著降低(P<0.05)；入院2 w后腦卒中后抑郁組、原發性抑郁組、腦卒中組較入院1 w內 P300潛伏期顯著縮短，P300波幅顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

2.2各組外周血Arnt2、Npas4 mRNA表達情況 腦卒中后抑郁組和原發性抑郁組Arnt2 mRNA相對表達量明顯高于腦卒中組和對照組，Npas4 mRNA相對表達量明顯低于腦卒中組和對照組(均P<0.05)；腦卒中后抑郁組Arnt2 mRNA和Npas4 mRNA相對表達量與原發性抑郁組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖2。

表1 各組入院1 w內和2 w后 P300潛伏期、波幅比較

與對照組相比：1)P<0.05；與原發抑郁組相比：2)P<0.05；與腦卒中組相比：3)P<0.05；與入院1 w內比較：4)P<0.05

圖1 各組事件相關電位P300波形

組別nArnt2 mRNANpas4 mRNA腦卒中后抑郁組471.85±0.151)2)0.87±0.111)2)原發性抑郁組521.41±0.241)2)0.82±0.231)2)腦卒中組451.03±0.321.31±0.44對照組290.86±0.101.24±0.47

與腦卒中組相比：1)P<0.05；與對照組相比：2)P<0.05

圖2 各組Arnt2、Npas4 mRNA擴增電泳圖

2.3各組外周血Arnt2、Npas4 蛋白表達情況 腦卒中后抑郁組和原發性抑郁組Arnt2 蛋白相對表達量分別為(5.91±1.13)、(5.57±0.96)，明顯高于腦卒中組和對照組(3.26±1.38)、(2.91±1.05)；Npas4 蛋白相對表達量分別為(2.51±0.84)、(2.40±0.93)，明顯低于腦卒中組和對照組(7.16±1.18)、(7.86±1.29)，差異均有統計學意義(均P<0.05)；腦卒中后抑郁組Arnt2和Npas4蛋白表達與原發性抑郁組比較差異無統計學意義(均P>0.05)。見圖3。

圖3 各組外周血Arnt2、Npas4 蛋白電泳條帶

3 討 論

老年人群中抑郁癥患病率高達10%～20%〔4〕，目前認為老年抑郁癥的發生多由應激事件或年齡相關大腦退行性病變誘發，導致長期下丘腦-腎上腺-皮質醇功能失調，皮質醇分泌量增加，長期作用于海馬中相應受體引發海馬萎縮和功能喪失〔5〕。腦細胞屬于不可再生的永久性細胞，腦卒中可造成大腦神經細胞損傷，易出現抑郁及認知功能障礙，其不但增加了家庭和社會負擔，還提升了患者死亡率〔6〕。事件相關電位中P300受外界物理因素影響程度較小，能夠較為客觀地反映受試者記憶、感知等大腦高級功能情況，因此本研究觀察患者P300波幅和潛伏期的變化〔7〕。研究結果提示腦卒中后抑郁和腦卒中后均會出現認知功能障礙，且腦卒中后抑郁患者認知功能損傷更為嚴重；腦卒中后抑郁患者與原發抑郁者相比，不僅存在精神運動障礙，還會減慢大腦對外界信息的處理速度，腦卒中對大腦組織的損傷也會加重認知功能傷害。

Arnt2屬于堿性螺旋轉錄因子超家族，在細胞周期、分化、應激反應相關調控基因表達網絡中起重要調控作用〔8〕。Npas4與Arnt2屬于相同家族，在大腦發育、突觸生成和維護等方面發揮重要作用，是大腦重塑的關鍵因子〔9〕。動物實驗顯示，孤氧并行為限制的小鼠海馬體積較正常同齡小鼠降低7.2%，并伴有神經受損，其中海馬中的Npas4表達明顯下調，Arnt2表達明顯上調〔10〕，提示Npas4表達下調和Arnt2下調可能應激誘導海馬功能損傷。相關研究顯示，Arnt和Npas家族成員廣泛分布于人淋巴組織中，故本次研究通過外周血分離白細胞，檢測其中Arnt2 和Npas4 mRNA和蛋白表達水平〔11〕。本研究結果說明Arnt2高表達和Npas4低表達可誘導海馬神經功能受損，使患者出現情緒失調，引發認知障礙。