COPD肺部炎癥反應與血管重構中PPAR-α及TLR4表達的關系

王 旭 鄒新中 張彩娣 左志通 陳寶華

(無錫市第三人民醫院呼吸科，江蘇 無錫 214041)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是我國高發的呼吸系統疾病，致死率和自殘率均很高〔1〕。目前，肺實質和肺血管中的慢性炎癥反應和血管重構是醫學界公認的COPD發病基礎。炎癥反應可引發支氣管壁損傷-修復過程反復進行，誘導血管重構，而在此過程中過氧化物酶體增殖體激活受體(PPAR)和Toll樣受體(TLR)發揮重要作用〔2〕。動物實驗顯示，PPAR-α在支氣管哮喘小鼠的血管重構過程中發揮明顯調控作用〔3〕；TLR4可通過介導炎性反應來影響ACEⅡ所致高血壓小鼠體內血管重構〔4〕，然而PPAR-α及TLR4在COPD患者肺血管重構中的作用尚不清楚。本次研究以人體肺組織標本為研究對象，檢測COPD患者與非COPD患者肺組織中PPAR-α及TLR4表達情況，探討其在炎性反應和血管重構中的作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年6月至2015年10月無錫市第三醫院院行手術治療的肺鱗癌患者62例。術中在切除肺葉的同時收集遠離癌組織的正常肺組織為研究標本。根據術前患者肺功能指標并依據COPD診斷標準，將入選患者分為COPD組30例，非COPD組32例。COPD組中男27例，女3例，年齡58～81歲，平均(67.92±7.08)歲；非COPD組中男27例，女5例，年齡57～79歲，平均(67.35±5.41)歲。兩組患者性別、年齡之間差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 Trizol試劑盒購于上海法默生物科技有限公司；RIPA試劑盒購于上海閃晶分子生物科技有限公司；兔抗人PPAR-α抗體、兔抗人TLR4抗體、鼠源性β-actin單抗、辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購于上海信裕生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1肺組織形態學觀察 術中收集的肺組織標本常規行石蠟包埋，0.3 μm連續切片，脫蠟至純水中，蘇木素-伊紅(HE)染色，封片并觀察。肺動脈直徑觀察范圍為150～450 μm，同時評價肺動脈及其周圍炎性細胞浸潤程度。評價標準：0分為無浸潤；1分為存在少量炎性細胞浸潤；2分為炎性細胞浸潤較多，但分布不均勻；3分為炎性細胞浸潤較多且分布均勻，但未出現聚團現象；4分為炎性細胞浸潤分布均勻且聚團。隨機選出6條橫斷面形態完整的肺小動脈，測量管壁厚度、面積、內徑和外徑，計算肺小動脈血管壁橫斷面面積與血管總面積的比值(WA%)，小動脈血管壁厚度與外徑的比值(WT%)。

1.3.2RT-PCR法檢測肺組織PPAR-α和TLR4 mRNA表達 Trizol法提取兩組患者肺組織總RNA用分光光度法測定濃度，逆轉錄試劑盒獲得cDNA。引物由上海魯汶生物科技有限公司合成，總反應體系20μl，反應條件：94℃ 10 min，94℃ 5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共40個循環，72℃延伸10 min。擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，掃描得到目標條帶灰度值，以β-actin為內參計算PPAR-α、TLR4 mRNA的相對表達量。

1.3.3Western印跡法檢測肺組織PPAR-α和TLR4蛋白表達 RIPA試劑盒提取肺組織總蛋白70 g，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂奶粉封閉2 h后分別滴加兔抗人PPAR-α、TLR4一抗(1∶500稀釋)，鼠源性β-actin單抗(1∶1 000)為內參，4℃冷藏孵育過夜，滴加HRP標記的二抗，孵育4 h，電化學發光(ECL)顯色，暗室中顯影、采集圖像，分析各條帶灰度值。

1.3.4免疫組化法檢測肺組織PPAR-α和TLR4陽性細胞比例與分布 取兩組患者肺組織石蠟切片，脫蠟、熱修復抗原，H2O2封閉內源性過氧化物酶30min，滴加兔抗人PPAR-α、TLR4一抗，4℃冷藏過夜，滴加生物素標記的二抗，37℃孵育2 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯示、蘇木精復染，封片固定，采集圖片并使用Image pro Plus 5.0軟件分析。

1.4統計學分析 使用SPSS16.0軟件進行t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1肺組織形態學和血管炎癥及重建程度比較 HE染色后顯微鏡下觀察，COPD組肺組織中肺泡形態和支氣管黏膜不完整，肺小動脈血管壁及周圍存在明顯炎性細胞浸潤；非COPD組肺泡結構和支氣管黏膜完整，小動脈血管壁結構完整，且無明顯增厚，周圍未發現或極少量炎性細胞浸潤(見圖1)。COPD組炎癥評分明顯高于非COPD組(P<0.01)；COPD組WA%、WT%明顯高于非COPD組差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2兩組患者肺組織中PPAR-α及TLR4 mRNA和蛋白表達情況 RT-PCR檢測顯示，COPD組PPAR-α mRNA相對表達量為1.62±0.58，明顯低于非COPD組的3.85±0.74；COPD組TLR4 mRNA相對表達量為2.30±0.35，明顯高于非COPD組的0.91±0.27；差異均有統計學意義(P<0.01)。Western印跡檢測顯示，COPD組PPAR-α 蛋白相對表達量為14.38±1.96，明顯低于非COPD組的20.65±0.42；COPD組TLR4蛋白相對表達量為25.71±0.39，明顯高于非COPD組的17.24±0.50；差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

表1 兩組肺組織血管炎癥及重建程度比較

與非COPD組比較：1)P<0.01

圖1 兩組患者肺組織HE染色(×400)

圖2 Western印跡檢測肺組織中PPAR-α及TLR4蛋白表達

2.3PPAR-α和TLR4陽性細胞表達及分布情況 免疫組化檢測顯示，PPAR-α和TLR4陽性反應均為棕黃色顆粒，兩者主要表達于肺血管平滑肌細胞的胞質和胞核。COPD組PPAR-α陽性細胞比例為(13.15±4.93)%，明顯低于非COPD組的(31.38±6.04)%(P<0.01)。COPD組TLR4陽性細胞比例為(27.30±6.42)%，明顯高于非COPD組的(15.53±4.05)%(P<0.01)。見圖3。

圖3 兩組PPAR-α和TLR4免疫組化檢測(×400)

3 討 論

COPD發病與外部環境中有害物質刺激肺部導致非正常性炎癥反應有關，病理特征以肺部血管和氣道重構造為主。本次研究中，COPD患者肺小動脈血管壁厚度和明顯小于非COPD患者，WA%、WT%明顯高于非COPD患者，提示肺部血管重構中肺小動脈血管重構明顯。相關研究顯示，COPD患者肺部血管重構主要因肺部缺氧導致〔5〕；而最新研究發現，COPD發病早期就已出現肺部血管重構，在肺部未出現缺氧時已發生炎癥反應〔6〕，提示肺部炎癥反應可能是引發肺部血管重構的起始原因。本次研究顯示，存在肺小動脈血管的COPD患者肺部炎性細胞浸潤程度明顯高于非COPD患者，同時炎癥評分明顯增高。

COPD發病過程中體內多種影響炎癥反應的細胞因子可發揮促進或抑制作用。動物實驗顯示，PPAR-α可通過影響AP-1、STAT等因子轉錄來抑制支氣管哮喘小鼠的血管重構，呈明顯的負相關〔7〕。以此為基礎，本次研究對PPAR-α在COPD患者肺組織中的作用進行了分析，結果顯示COPD患者肺組織中PPAR-α mRNA和蛋白表達水平均較非COPD患者明顯降低，PPAR-α陽性細胞比例也明顯低于非COPD患者。提示人肺部PPAR-α表達下調可降低抗炎作用，促進肺部血管重構。TLR4屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白的免疫分子，能夠經病原微生物與細胞壁產物之間的作用激活免疫系統。相關研究顯示，TLR4可通過介導炎性反應來影響ACEⅡ所致高血壓小鼠體內血管重構〔8〕，但其在COPD患者肺部血管重構中的作用仍鮮有報道。本次研究顯示，COPD患者肺組織中TLR4 mRNA和蛋白表達水平均較非COPD患者明顯升高，PPAR-α陽性細胞比例也明顯高于非COPD患者，提示人肺部TLR4表達上調可促進炎性反應，加快肺部血管重構。

綜上所述，COPD組患者肺血管均出現不同程度的重構，PPAR-α抗血管重構的機制與減輕炎癥對血管損傷有關；TLR4參與血管重構的機制與加重炎癥反應，促進血管壁細胞外基質增加有關。