阿托伐他汀對1型糖尿病大鼠腎損傷的保護作用及機制

胡瓊丹 胡柯琴 樊均明

(西南醫科大學附屬中醫醫院腎病內科，四川 瀘州 646000)

糖尿病的高血糖狀態能夠誘發腎組織血管產生炎癥病變，同時伴有顯著的血管內皮細胞改變，包括腎內血管通透性增加、小球基底膜增厚等〔1～4〕。轉化生長因子(TGF)-β/Smad與1型糖尿病患者體內腎臟纖維化、腎臟的病理損傷密切相關〔5〕。齊淑芳等〔6〕證明了山楂葉總黃酮能夠通過TGF-β/Smad通路抑制1型糖尿病大鼠腎臟纖維化，減輕糖尿病腎臟所受的損害。羥甲基戊二酰輔酶(HMG-Co)A還原酶抑制劑能夠降低腎內炎癥性因子水平，從而抑制腎內炎癥反應，保護腎血管內皮細胞〔7〕。本研究旨在探討阿托伐他汀(ATO)對糖尿病大鼠腎損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1動物與分組 40只健康雄性成年SD大鼠，購自上海靈暢生物科技有限公司，實驗動物生產合格證號：SCXK(滬)2013-0018，體重260～300 g，平均(281.82±11.75)g，實驗室溫度20～24℃，正常光照，自由飲食、活動，適應性飼養1 w。隨機分為A組(健康對照組)，B組(糖尿病模型組)，C組(健康大鼠ATO干預組)，D組(糖尿病大鼠ATO干預組)各10只。

1.2試劑與設備 鏈尿佐菌素(STZ，美國sigma公司)，ATO鈣片(美國輝瑞公司)，化學發光免疫分析法(CLIA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)，全自動生化分析儀(ES-380，南京頤蘭貝生物科技有限責任公司)，酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)，RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(美國Thermo公司)，兔抗大鼠Smad2多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β1單克隆抗體、兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體(美國Santa公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、生物素標記羊抗兔IgG(上海英基生物科技有限公司)，ECL發光液(美國Millipore公司)，凝膠成像儀(美國UVP公司)，分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)，其他試劑均采用國產分析純。

1.3方法

1.3.1模型制備 糖尿病組大鼠(B組與D組)，隔夜禁食12 h，每24 h腹腔注射STZ(55 mg/kg)，A組與C組同時腹腔注射同等劑量的生理鹽水，注射兩次。STZ處理48 h后，每只大鼠均隨機檢測2次尾靜脈血的血糖濃度，穩定高于16.7 mmol/L，表明模型建立成功。建模成功后，進行ATO干預：C組與D組將ATO鈣片溶于生理鹽水，制成0.5 mg/ml溶液，按10 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃，持續8 w。同時，A組與B組將空白淀粉片溶于生理鹽水，制成0.5 mg/ml溶液，按10 mg·kg-1·d-1的劑量灌胃，持續8 w。

1.3.2樣本收集 ATO干預后的第1、2、4、8周，收集各組大鼠的24 h尿，檢測尿白蛋白(UAL)水平；尾靜脈采血檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)含量。

干預8 w后，各組大鼠采用頸椎脫臼法處死。摘取腎臟，預冷的生理鹽水沖洗后，-20℃保存，左側腎組織預備用于檢測炎癥因子水平，另一側腎組織，待提取組織蛋白用于Western印跡檢測。

1.3.3生化檢查 CLIA法檢測尿中UAL含量，全自動全化分析儀檢測血清BUN、Scr含量及實驗結束時的空腹血糖值。

1.3.4ELISA檢測相關指標 ELISA檢測腎組織中白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、前列腺素(PG)E2、腫瘤壞死因子(TNF)-α和C反應蛋白(CRP)水平。上述實驗均嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.3.5Western印跡法檢測TGF-β1和Smad2蛋白表達 取各組大鼠的腎組織，加入RIPA蛋白裂解液，勻漿后，提取組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，采用濕轉法將蛋白轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下5%脫脂奶粉振蕩封閉1 h，TBS-T洗膜，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體，兔抗大鼠Smad2多克隆抗體，兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體，4℃孵育過夜。TBS-T洗膜，加入HRP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，加ECL發光液進行化學發光顯影，采用凝膠成像儀對蛋白條帶進行觀察，獲取圖像，采用Image Lab軟件對圖像進行灰度分析，記錄灰度值，同時計算目的蛋白與內參蛋白的灰度比值。

1.4統計學處理 應用SPSS20.0軟件進行方差分析(ANOVA)、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠體重和空腹血糖情況 單因方差分析顯示8 w實驗結束后，各組大鼠的體重和空腹血糖比較差異有統計學意義(P<0.05)。D組大鼠體重明顯高于B組，但明顯低于A組和C組，差異均有統計學意義(P<0.05)，C組與A組比較差異無統計學意義(P>0.05)；同時，B組與D組空腹血糖明顯高于A組，差異均有統計學意義(P<0.05)，但D組與B組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 實驗結束時各組大鼠體重、空腹血糖比較

1)，2)，3)分別為與A，B，C組比較：P<0.05，下表同

2.2各組大鼠腎組織中炎癥因子的變化 單因素方差分析顯示，8 w實驗結束后，各組大鼠之間的腎內炎癥因子水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。與B組相比，D組大鼠腎組織中的炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-10、PGE2、TNF-α、CRP)水平顯著降低(P<0.05)，且與A組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)；而C組大鼠腎組織中炎癥因子的水平與A組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組大鼠腎功能的變化情況 經兩因素重復測量方差分析發現，各指標組間整體差異均有統計學意義(P<0.05)，而時間及分組與時間的交互作用差異無統計學意義(P>0.05)。實驗的8 w全過程中，A組與C組大鼠的腎功能各項指標差異均無統計學意義(P>0.05)。與A組相比，B組大鼠UAL、BUN、Scr水平顯著升高(P<0.05)；與C組相比，D組大鼠腎組織中UAL、BUN、Scr水平顯著升高(P<0.05)。在第1周和第2周時，D組大鼠腎組織中UAL、BUN、Scr水平與B組相對接近，實驗第4周和第8周，D組腎組織中UAL、BUN、Scr水平顯著低于B組(P<0.05)，但仍明顯高于A組(P<0.05)。見表3。

表2 各組大鼠腎內炎癥性因子水平比較

2.4各組大鼠腎臟組織TGF-β1和Smad2蛋白的表達 Western印跡法結果經單因素方差分析顯示，各組大鼠腎臟組織TGF-β1和Smad2蛋白的表達差異均有統計學意義(P<0.05)。D組腎組織中TGF-β1蛋白的相對表達水平低于B組(P<0.05)，但仍然高于A組(P<0.05)。TGF-β1蛋白的相對表達水平A組與C組比較差異無統計學意義(P>0.05)。D組腎組織中Smad2蛋白的相對表達水平低于B組(P<0.05)，但仍然高于A組(P<0.05)，Smad2蛋白的相對表達水平在A組與C組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖1。

表3 各時相點大鼠的腎功能的指標變化情況

1)，2)，3)分別為和A，B，C組相比：P<0.05；4)為和第1周相比：P<0.05；下表同

表4 各組大鼠腎臟組織TGF-β1和Smad2蛋白相對表達量比較

圖1 各組大鼠腎臟組織TGF-β1和Smad2蛋白表達水平

3 討 論

研究表明，糖尿病可導致多組織的慢性損害、功能障礙，如眼、腎、心臟、血管、神經等，由糖尿病并發癥導致的死亡僅次于心腦血管疾病和惡性腫瘤〔8，9〕。糖尿病按其發病原因可大致分為胰島素分泌缺陷或(和)胰島素作用缺陷。其中I型糖尿病是糖尿病的一種重要分型，屬于自身免疫性疾病，以胰島β細胞被進行性破壞為特點，表現為胰島素分泌的絕對減少。廣譜抗生素STZ具有對胰島β細胞的選擇性毒性，能夠引起胰島素的絕對分泌不足，因而被廣泛用作糖尿病動物模型的誘導劑。STZ已被證實能夠穩定、高效地誘導建立大鼠1型糖尿病模型。

近年來，應用非經典糖尿病藥物防治糖尿病并發癥是糖尿病研究領域的熱點。有研究認為，他汀類藥物對糖尿病患者腎臟具有保護作用〔10〕。本研究發現，ATO能夠增加糖尿病大鼠的體重，但對糖尿病大鼠的空腹血糖并無影響。

經STZ誘導建立1型糖尿病模型后，腎功能受到明顯損害〔11〕，而單純ATO干預并不會影響健康大鼠的腎臟功能。從第4周開始，D組大鼠腎功能指標都較B組有所回落，提示經ATO干預后大鼠的腎臟功能有所恢復。可見ATO能夠減輕糖尿病對大鼠腎臟造成的損害〔12〕。

本研究表明ATO能夠減少糖尿病大鼠腎臟組織內炎癥性因子〔13,14〕，從而降低糖尿病腎臟中的炎癥水平，同時并不會影響到正常健康的大鼠。已有研究證實，TGF-β1/Smads信號通路參與了糖尿病腎病的病情進展過程〔15,16〕，TGF-β1過表達多會促進糖尿病腎臟纖維化的發生〔17〕。本研究提示ATO能夠選擇性抑制TGF-β1/Smads信號通路活化。本研究推測，當大鼠被STZ誘導建立起糖尿病模型后，TGF-β1/Smads信號通路活性增加，從而對腎臟造成一定的損害。當ATO干預后，由于其能夠抑制TGF-β1/Smads信號通路，糖尿病腎臟所受損害在一定程度上得到了減輕。這可能也是ATO改善糖尿病大鼠腎功能的一種機制。

綜上所述，ATO能夠增加糖尿病大鼠的體重，并且不影響其空腹血糖；能夠減少糖尿病對腎臟的損害，保護腎臟，減少糖尿病腎病的發生。單純ATO干預不會對健康大鼠造成腎臟方面的不良影響，這為今后拓展糖尿病控制、治療的研究提供了新的方向。