三氧化二砷聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響及機(jī)制

郭天利 李宏健 龐 慧 焦同立 李春艷 于法明

(焦作市第二人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 焦作 454001)

三氧化二砷(As2O3)是一種劇毒，但在治療疾病方面具有重要作用，如治療急性早幼粒白血病具有較好的療效〔1〕。近年來(lái)的研究顯示，As2O3具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，對(duì)多種腫瘤如肝癌〔2〕、肺癌〔3〕、胃癌〔4〕、結(jié)腸癌〔5〕等均發(fā)揮一定的抑制作用。但在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，As2O3濃度過(guò)高會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用〔6〕。因此，為了減少As2O3的毒副作用及提高其作用效果，臨床上常采取聯(lián)合用藥的方式。白藜蘆醇是一種分布范圍較廣的天然多酚，能通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲，是一種高效預(yù)防腫瘤的藥物。研究發(fā)現(xiàn)，As2O3聯(lián)合白藜蘆醇可增強(qiáng)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，從而抑制腫瘤的發(fā)展〔7,8〕。但關(guān)于二者聯(lián)合使用對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲、遷移的相關(guān)作用及機(jī)制的研究較少。本研究旨在觀察As2O3聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響，并探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，As2O3購(gòu)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)有限公司，白藜蘆醇、Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清、胰酶(含EDTA)購(gòu)自美國(guó)Hyelone公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，細(xì)胞裂解液及聚氨基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，β肌動(dòng)蛋白(actin)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、MMP-9抗體購(gòu)自武漢博士德公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(HRP)的山羊抗兔二抗購(gòu)自北京康為公司，波形蛋白(Vimentin)抗體、鈣黏蛋白E(E-cadherin)抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自上海生物儀器廠，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)寶特公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó)Syngene公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)與處理 肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包含10%胎牛血清及1%的青-鏈霉素，置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，每3 d傳代一次。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞加入不同濃度白藜蘆醇聯(lián)合10 μmol/L As2O3進(jìn)行處理24 h，對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度白藜蘆醇(15、30、60、120 μmol/L)進(jìn)行干預(yù)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入100 μl MTT(5 mg/ml)，37℃避光培養(yǎng)4 h；棄去孔內(nèi)液體，每孔加入100 μl DMSO，室溫振蕩5 min，酶標(biāo)儀中檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下吸光值OD570 nm。計(jì)算細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD570 nm/對(duì)照組OD570 nm×100%。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前48 h，將各組細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/ml，接種于6孔板中，加入60 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合10 μmol/L As2O3處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，待細(xì)胞的密度約為90%時(shí)，使用無(wú)血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，采用20 μl無(wú)菌槍頭在細(xì)胞層中快速劃1～2道痕。吸出上清，無(wú)菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞并更換為含胎牛血清的培養(yǎng)基，記錄細(xì)胞0 h和24 h的距離，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.5細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 將-20℃冰箱中的Matrigel膠放入4℃冰箱中過(guò)夜，與9倍體積的無(wú)血清培養(yǎng)基混勻。吸取50 μl Matrigel膠稀釋液加入Transwell上室底部，37℃孵育3 h。收集各組細(xì)胞，使用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，調(diào)整為1×104個(gè)細(xì)胞和200 μl加入Transwell上室，下室加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h；1倍PBS清洗上室，濕棉簽擦盡殘留細(xì)胞，1%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色，37℃孵育5 min，顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)，取5個(gè)視野的平均值。遷移實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，Transwell上室底部不加入Matrigel膠稀釋液，其余步驟與侵襲相同。

1.6細(xì)胞中MMP-2、MMP-9及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)蛋白的變化 收集對(duì)照組、60 μmol/L白藜蘆醇和10 μmol/L As2O3處理的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，離心，吸取上清，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。配置適宜的分離膠和濃縮膠，吸取50 μg蛋白樣品，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉封閉1 h；加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗，37℃孵育2 h，加入ECL液顯色，凝膠成像系統(tǒng)中拍照，Quantity One分析與內(nèi)參β-actin的灰度值比值，表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件，多組計(jì)量數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1As2O3聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的白藜蘆醇作用于肺癌A549細(xì)胞，48 h后細(xì)胞的存活率〔15、30、60、120 μmol/L白藜蘆醇組細(xì)胞存活率分別為(89.254±5.749)%，(72.369±3.687)%，(52.967±4.584)%，(38.214±2.457)%〕較對(duì)照組〔(100.003±0.008)%〕顯著降低(P<0.05)；隨著白藜蘆醇藥物濃度的增加，細(xì)胞的存活率逐漸降低(P<0.05)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，白藜蘆醇的半數(shù)抑制濃度(IC50)為58.367 μmol/L。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以60 μmol/L白藜蘆醇作為實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2As2O3聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移的影響 與對(duì)照組相比，10 μmol/L As2O3和60 μmol/L白藜蘆醇單獨(dú)作用于A549細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的修復(fù)速度和遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，但二者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與As2O310 μmol/L組和白藜蘆醇60 μmol/L組相比，As2O3+白藜蘆醇組細(xì)胞的修復(fù)速度和遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 As2O3聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)肺癌A549細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組相比：1)P<0.05；與As2O310 μmol/L相比：2)P<0.05；與白藜蘆醇60 μmol/L相比：3)P<0.05；下表同

2.3As2O3聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲的影響 與對(duì)照組〔(115.32±16.478)個(gè)〕相比，10 μmol/L As2O3和60 μmol/L白藜蘆醇單獨(dú)作用于A549細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)〔(82.412±9.587)個(gè)，(79.368±8.789)個(gè)；P<0.05〕顯著降低；二者單獨(dú)使用時(shí)細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與As2O310 μmol/L組和白藜蘆醇60 μmol/L組相比，As2O3+白藜蘆醇組細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低〔35.269±5.784)個(gè)，P<0.05〕。

2.4As2O3聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)肺癌A549細(xì)胞中MMP-2、MMP-9及EMT蛋白的影響 與對(duì)照組相比，10 μmol/L As2O3和60 μmol/L白藜蘆醇單獨(dú)作用于A549細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)，下調(diào)Vimentin蛋白(P<0.05)，上調(diào)E-cadherin蛋白(P<0.05)；與As2O310 μmol/L組和白藜蘆醇60 μmol/L組相比，As2O3+白藜蘆醇組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白顯著降低(P<0.05)，抑制Vimentin蛋白表達(dá)(P<0.05)，促進(jìn)E-cadherin蛋白水平(P<0.05)。As2O310 μmol/L組與白藜蘆醇60 μmol/L組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 As2O3聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)肺癌A549細(xì)胞中MMP-2、MMP-9及EMT蛋白的影響

組別MMP-2/β-actinMMP-9/β-actinVimentin/β-actinE-cadherin/β-actin對(duì)照組0.823±0.0890.653±0.0660.562±0.0570.649±0.068As2O3 10 μmol/L組0.689±0.0751)0.482±0.0451)0.420±0.0431)0.856±0.0821)白藜蘆醇60 μmol/L組0.692±0.0711)0.463±0.0481)0.436±0.0481)0.834±0.0871)As2O3+白藜蘆醇組0.423±0.0451)2)3)0.247±0.0261)2)3)0.215±0.0241)2)3)1.145±0.1691)2)3)

3 討 論

肺癌組織易發(fā)生轉(zhuǎn)移，對(duì)常規(guī)的化學(xué)治療藥物不敏感，是其死亡率較高的主要原因之一。白藜蘆醇是一種天然的多酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的生物特性。研究已經(jīng)證實(shí)，白藜蘆醇對(duì)多種腫瘤如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等具有顯著的預(yù)防作用〔9,10〕。As2O3也是近年來(lái)研究的相對(duì)較多的抗腫瘤藥物。報(bào)道顯示，As2O3可作用于Bcl-2家族，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡〔11〕。在人腎母細(xì)胞瘤中，As2O3可抑制CyclinD1蛋白的表達(dá)量，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡〔12〕。在食管癌中，As2O3能有效抑制細(xì)胞的侵襲及血管生成能力，可能與阻礙食管癌細(xì)胞間的黏附力及運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)〔13〕。在探究抗腫瘤藥物的聯(lián)合使用效果時(shí)，常選用10 μmol/L As2O3作為研究對(duì)象〔14〕。在本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度白藜蘆醇(15、30、60、120 μmol/L)作用于肺癌細(xì)胞，隨著濃度的增加，細(xì)胞的存活率逐漸降低。

在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)黏附作用的改變發(fā)揮重要作用。在此過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌和表達(dá)相關(guān)蛋白酶如組織蛋白酶、MMPs等，促進(jìn)組織基質(zhì)的降解及血管的生成，從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用〔15,16〕，其中以MMP-2、MMP-9蛋白的作用最關(guān)鍵〔17〕。此外，EMT過(guò)程與腫瘤組織轉(zhuǎn)移、細(xì)胞的分化等密切相關(guān)。EMT過(guò)程以E-cadherin上皮標(biāo)志物表達(dá)降低、Vimentin等間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)增加為主要特征。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲、遷移能力〔18〕。在胃癌細(xì)胞中，As2O3和白藜蘆醇均可通過(guò)調(diào)控MMP-2、MMP-9蛋白水平參與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移過(guò)程〔19,20〕。白藜蘆醇還可調(diào)控EMT蛋白表達(dá)，抑制EMT，降低食管癌細(xì)胞的侵襲、遷移〔21〕。本研究表明，As2O3和白藜蘆醇聯(lián)合抑制細(xì)胞的侵襲、凋亡與MMPs水平及EMT過(guò)程有關(guān)。

綜上所述，As2O3和白藜蘆醇聯(lián)合使用可增加二者抑制肺癌細(xì)胞侵襲、遷移的能力，其可能的作用機(jī)制與二者聯(lián)合處理進(jìn)一步降低細(xì)胞中MMPs的水平、抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解和EMT過(guò)程有關(guān)。