中藥補陽還五湯對大鼠腦出血神經(jīng)元凋亡及磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶蛋白表達的影響

孟 杰 劉云霞 吳曉光 李蒙蒙 仇志富 孫大永

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000)

腦出血可導(dǎo)致組織發(fā)生神經(jīng)元凋亡，抑制細胞凋亡可以保護腦損傷〔1〕。補陽還五湯是臨床上用于治療腦缺血后遺癥的常用藥物，具有抗氧化，提高微血管密度，增加腦組織血流量，抑制神經(jīng)元凋亡、促進神經(jīng)修復(fù)再生等作用〔2～4〕，然而其對出血腦組織細胞凋亡的影響卻鮮有報道。本研究觀察補陽還五湯對腦出血模型大鼠血腫周圍腦組織細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物、試劑 雄性、成年SD大鼠96只，體重240～280 g(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001)。補陽還五湯(同仁堂承德分公司，批號：2015134)，銀杏葉片(北京雙鶴藥業(yè)有限公司，批號：20151013)；兔抗大鼠多克隆抗體Bax、Bcl-2(上海延生實業(yè)有限公司)； 轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記(TUNEL)試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)。

1.2模型制作、分組 將大鼠編號及記錄體重，按照Rosenberg法〔5〕制備腦出血模型，造模后第2天開始，分別灌胃給予假手術(shù)組(等量生理鹽水)、模型組(等量生理鹽水)、補陽還五湯組(26 g·kg-1·d-1)和銀杏葉片組(3.5 mg·kg-1·d-1)，灌胃14 d。按照隨機每組24只分為假手術(shù)組、模型組、補陽還五湯組、銀杏葉片組。

1.3神經(jīng)功能障礙評分 神經(jīng)功能行為學(xué)評分采用雙盲、Garcia〔6〕法。

1.4TUNEL法檢測細胞凋亡 嚴格按照試劑盒操作說明檢測凋亡。

1.5免疫組化檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達 腦組織切片(5 μm)，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法免疫組化染色，兔抗大鼠一抗Bax(1∶100)、Bcl-2(1∶150)。圖像處理軟件(Image pro plus5.01)分析切片，每組6張，每張選取6個不同視野，計算陽性表達積分光密度值(IOD)。

1.6Western印跡檢測蛋白磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)的表達 提取蛋白，定量，每組按照 30 μg 總蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，傾去封閉液，滴加稀釋好的一抗p-ERK(1∶60)孵育3 h(室溫)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜3次，每次5 min，再滴加二抗，溫箱內(nèi)孵育1 h(37℃)，同法洗膜3次，暗室內(nèi)用電化學(xué)發(fā)光(ELC)液顯影，最后用Quantity One軟件分析統(tǒng)計結(jié)果。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能評分 大鼠造模后6 h進行神經(jīng)功能評分，模型組出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)功能障礙，無法攀援、追尾，站立不穩(wěn)，左側(cè)肢體無力等現(xiàn)象；神經(jīng)功能評分〔(8.24 ±1.56)分〕顯著低于假手術(shù)組〔(17.32 ±0.76)分〕(P<0.05)。與模型組相比，補陽還五湯和銀杏葉片兩組評分顯著升高〔(12.85±1.62)、(13.01±1.54)分〕(P<0.05)。

2.2TUNEL法檢測細胞凋亡數(shù)量的變化 假手術(shù)組大腦皮質(zhì)內(nèi)僅有零星的、散在的TUNEL陽性表達細胞。模型組腦出血組織內(nèi)陽性細胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，補陽還五湯組和銀杏葉片組陽性細胞顯著減少(P<0.05)，補陽還五湯組和銀杏葉片組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表1。

2.3免疫組化檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達 神經(jīng)元胞質(zhì)呈棕黃色為陽性表達。假手術(shù)組中Bax、Bcl-2的表達很少。補陽還五湯組和銀杏葉片組與模型組相比，Bax表達量明顯降低，Bcl-2增加，Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05)。補陽還五湯組與銀杏葉片組Bcl-2/Bax比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表1。

2.4Western印跡檢測p-ERK蛋白表達 與假手術(shù)組相比，模型組p-ERK蛋白表達有所增加；補陽還五湯組和銀杏葉片組與模型組相比，p-ERK表達增加(P<0.05)，提示補陽還五湯誘導(dǎo)p-ERK表達增加，可能激活下游PI3K/ERK信號通路。見表1和圖3。

圖1 TUNEL法檢測各組腦出血組織中細胞凋亡的表達(×400)

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測各組腦出血組織Bcl-2、Bax蛋白表達(×400)

組別p-ERK(灰度值)TUNEL陽性細胞(個/視野)Bcl-2(個/視野)Bax(個/視野)Bcl-2/Bax(個/視野)假手術(shù)組5.37±1.260.96±0.055.47±1.754.32±1.721.26±1.02模型組6.81±1.291)6.13±2.511)9.18±2.241)16.81±4.351)0.55±0.521)補陽還五湯組9.78±1.312)3.67±1.282)16.81±4.232)12.17±2.642)1.38±1.602)銀杏葉片組9.32±1.472)4.12±1.642)15.28±3.942)11.28±2.572)1.35±1.532)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

圖3 各組血腫周圍腦組織p-ERK蛋白表達

3 討 論

腦出血后血腫周圍腦組織神經(jīng)元凋亡的調(diào)控通路主要為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在這一通路中，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)具有抗凋亡作用，研究表明,ERK在腦缺血后損傷神經(jīng)的修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用〔7〕。ERK是MAPK信號通路的重要成員，具有調(diào)控細胞的生長與分化和調(diào)節(jié)炎癥與細胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)的作用〔8〕。ERK是MAPK家族的蛋白激酶，主要在細胞胞質(zhì)表達，在Raf-1因子的參與下可轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，活化成p-ERK。p-ERK 的激活即可以通過激活蛋白激酶(PK)A信號通路抑制Bad/Bcl-xL二聚合物的形成，也可以抑制Bad蛋白表達，從而可以阻斷細胞色素C的釋放，進一步抑制細胞凋亡〔9〕。Bcl-2通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用，而細胞凋亡是被認為引起腦出血后神經(jīng)功能缺損最重要的機制〔10〕。Bcl-2家族包括Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bad 等蛋白，其中Bcl-2和Bcl-xL蛋白具有抑制細胞凋亡的作用，而Bax和Bad 等蛋白具有促進細胞凋亡的作用〔11〕。位于線粒體膜上的Bcl-2/Bax蛋白，調(diào)控線粒體功能和凋亡相關(guān)蛋白的釋放，Bcl-2在Bax和Bcl-2形成異源二聚體時，發(fā)揮其抑制細胞凋亡的功能。本研究結(jié)果顯示，中藥補陽還五湯給藥后大鼠凋亡細胞數(shù)量顯著減少，神經(jīng)功能明顯改善。

綜上，補陽還五湯可以保護腦出血誘發(fā)的神經(jīng)元

損傷，機制與降低Bax蛋白表達并增加Bcl-2表達，提高Bcl-2/Bax比值而抑制神經(jīng)元凋亡可能有關(guān)。