上調miR-124表達誘導甲狀腺癌細胞凋亡的作用及其機制

金 潔 任躍忠 林海洋

(浙江大學醫學院附屬第二醫院內分泌科，浙江 杭州 310009)

甲狀腺癌根據組織發生和形態結構的不同可分為乳頭狀腺癌、濾泡性癌、髓樣癌和未分化癌，其中乳頭狀腺癌最常見〔1,2〕。目前，關于甲狀腺癌的診斷和治療手段比較單一，且治療效果并不理想。微小RNA(miRNA)是一類通過與下游基因mRNA互補配對，導致靶基因mRNA降解和蛋白翻譯受阻的內源性小分子RNA，大量研究顯示miRNAs與腫瘤的發生發展密切相關〔3,4〕。miR-124在胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌等多數腫瘤中具有抑癌作用，在腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和凋亡過程中具有重要作用〔5～7〕，但其對甲狀腺癌的作用機制尚不清晰。本文擬分析miR-124對甲狀腺癌細胞凋亡的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1主要材料與儀器 正常甲狀腺細胞系Nthy-ori3-1和甲狀腺乳頭狀癌細胞系SW579由中國科學院細胞庫提供。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素和RPMI1640培養液購于美國Sigma公司。

Has-miR-124 mimics、Has-miR-124 mimics NC和PCR擴增引物購于廣州銳博公司。RNAiso Plus試劑盒為日本TaKaRa公司產品，反轉錄試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量檢測試劑盒、膜聯蛋白-V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒和放射免疫沉淀(RIPA)細胞裂解液為上海碧云天公司產品。B細胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體、蛋白激酶B(AKT)抗體、磷酸化AKT(p-AKT)抗體、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α(PIK3CA)、β肌動蛋白(β-actin)抗體和辣過氧化物酶標記羊抗鼠或羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗為美國Cell Signaling Technology公司產品。細胞培養箱、PCR儀和流式細胞儀為美國Thermo公司產品。

1.2方法

1.2.1細胞培養 取儲存在液氮罐中的Nthy-ori3-1細胞和SW579細胞，迅速置于溫度為37℃的水浴鍋中融化復蘇。向收集到的細胞懸液中加入含有10%FBS、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培養液，在37℃、5%CO2和95%濕度的培養箱中常規培養，每2天更換1次培養液，待細胞成長完全貼壁后，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2實時熒光定量(qRT)-PCR檢測 收集培養至對數生長期的Nthy-ori3-1細胞和SW579細胞，采用RNAiso Plus試劑盒提取兩種細胞的總蛋白。采用反轉錄試劑盒獲得cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。miR-124上游引物為5′-TTTTAAGGCACGCGGTG-3′，下游引物為5′-TTTGGCACTAGCACATT-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。其中，PCR擴增條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s(共35個循環)；72℃總延伸300 s。以U6為內參，采用2-△△Ct法計算miR-124的表達水平，每組實驗重復3次。

1.2.3細胞分組及轉染 轉染前24 h，收集培養對數生長期的SW579細胞，隨機分為空白對照組、陰性對照組和miR-124模擬組?？瞻讓φ战M不做任何處理，陰性對照組加入Has-miR-124 mimics NC和Lipofectamine2000進行轉染，miR-124模擬組加入Has-miR-124 mimics和Lipofectamine2000進行轉染，具體操作步驟按照Lipofectamine2000試劑轉染說明書進行。

1.2.4轉染效果檢測 上述各組SW579細胞轉染6 h后，更換1次培養液，置于細胞培養箱中常規培養48 h。收集空白對照組、陰性對照組和miR-124模擬組對數生長期細胞，按照1.2.2中的操作步驟觀察各組細胞中miR-124的表達水平，檢測其轉染效果。

1.2.5Western印跡檢測 收集轉染48 h的空白對照組、陰性對照組和miR-124模擬組對數生長期細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，根據BCA檢測試劑盒檢測各組細胞總蛋白的濃度和純度。以每孔蛋白樣品30 μg上樣至濃度為10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中，電泳完畢后，經轉印、封閉后加入Bax抗體(1∶800稀釋)、Bcl-2抗體(1∶800稀釋)、AKT抗體(1∶1 000稀釋)、p-AKT抗體(1∶1 000稀釋)、PIK3CA抗體(1∶1 000稀釋)和β-actin抗體(1∶1 000稀釋)，在4℃條件下孵育24 h后，加入二抗(1∶2 000稀釋)，常溫條件下反應2 h后，以化學發光法顯色，曝光，采用凝膠電泳成像儀分析。以β-actin為內參，計算目的蛋白的相對表達水平。

1.2.6流式細胞儀檢測 收集轉染48 h的空白對照組、陰性對照組和miR-124模擬組細胞，調整細胞濃度為5×104個/ml后接種至6孔板中，經0.25%胰蛋白酶消化后，預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌、離心。每組取1 ml細胞，洗滌離心后加入200 μl結合緩沖液重懸細胞，每100 μl分別加入Annexin V、PI體積為5 μl和10 μl，混勻后避光條件下反應10 min，再加入400 μl結合緩沖液，上流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。

1.3統計學方法 應用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1miR-124在甲狀腺癌SW579細胞中的表達 miR-124在正常甲狀腺Nthy-ori3-1細胞中的表達量(1.02±0.03)明顯高于在SW579細胞中(0.32±0.05；t=20.793，P<0.05)。

2.2轉染Has-miR-124 mimics上調SW579細胞中miR-124表達 轉染48 h后，與空白對照組(1.05±0.12)相比，miR-124模擬組中miR-124的相對表達量(5.18±0.35)顯著升高(P<0.05)，而與陰性對照組(1.12±0.16)差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3上調miR-124表達誘導SW579細胞凋亡 3組凋亡率差異有統計學意義(F=69.463，P=0.000)。與空白對照組(6.58%±1.32%)相比，miR-124模擬組中SW579細胞凋亡率(22.65%±2.36%)顯著升高(P<0.05)，而陰性對照組(7.15%±1.86%)差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4上調miR-124表達對PIK3CA、AKT、p-AKT、Bcl-2及Bax表達的影響 與空白對照組相比，miR-124模擬組中PIK3CA、p-AKT和Bcl-2蛋白表達量均顯著降低，Bax蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，而AKT蛋白表達量變化不明顯(P>0.05)；陰性對照組和空白對照組PIK3CA、AKT、p-AKT、Bcl-2及Bax蛋白表達量差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 上調miR-124表達對PIK3CA、AKT、p-AKT、Bcl-2及Bax蛋白表達的影響

與空白對照組比較：1)P<0.05

3 討 論

miR-124是一個最初由RNA聚合酶Ⅱ轉錄而來的高度保守miRNA。人類成熟miRNA-124是由分別位于8p23.1染色體上的pre-miR-124-1、8q12.3染色體上的pre-miR-124-2和20q12.3染色體上的pre-miR-124-3剪切而來〔8，9〕。研究發現，miR-124在多數腫瘤中呈現低表達，與多種腫瘤的預后診斷和治療密切相關，在腫瘤細胞的增殖、侵染、轉移和凋亡等生理病理過程中發揮著重要作用〔10，11〕。Dong等〔10〕研究指出，miR-124在乳腺癌中表達下降與乳腺癌患者的預后不良有關。Zhang等〔11〕研究發現，miR-124在肺癌組織中的表達顯著低于癌旁正常組織，miR-124低表達組中肺癌患者5年內生存率明顯縮短。有研究發現，在MCF-7和MDA-MB-231細胞中干擾miR-124 表達后，細胞增殖和克隆形成明顯受到抑制，細胞凋亡率顯著升高〔12〕?；謴蚼iR-124在胃癌細胞中的表達，能夠通過靶向EZH2基因抑制胃癌細胞增殖和克隆形成，且與5-氟尿嘧啶聯合抗胃癌效果更佳〔13〕。甲狀腺癌的發生發展是一個復雜過程，與多種miRNAs的異常表達密切相關。近年來研究發現，miR-124在甲狀腺癌組織中呈現低表達，且干擾miR-124表達，可通過調控STAT3基因的表達影響K1細胞的增殖和侵襲〔14〕。

細胞凋亡是生物體內重要的生命活動，在甲狀腺癌發生發展、預后和產生耐藥性過程中發揮重要作用。細胞凋亡是由多種基因和蛋白共同調控的結果，Bcl-2家族蛋白通過直接或間接作用于線粒體在細胞凋亡過程中發揮關鍵的調控作用?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax作為Bcl-2家族蛋白中的重要成員，在包括甲狀腺癌等多種腫瘤組織中異常表達，與甲狀腺癌細胞凋亡密切相關〔15，16〕。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號通路在炎癥、腫瘤等疾病的發生發展過程中具有重要作用，通過上游分子與PI3K結合，磷酸化激活AKT，使PI3K/AKT信號通路活化參與腫瘤的調控。PI3K/AKT信號通路相關基因或分子異常表達所引起的功能獲得或缺失與多種惡性腫瘤細胞的增殖和凋亡等生物學特性轉變密切相關〔17〕。PIK3CA是PI3K/AKT信號通路中的關鍵分子，作為一種癌基因在多種腫瘤組織中異常表達，與腫瘤的診斷、治療及預后密切相關〔18，19〕。有研究發現，miR-124能夠通過激活PI3K/AKT信號通路在缺血性腦卒中發揮神經保護作用；過表達miR-124通過下調PIK3CA表達抑制肝癌HepG2細胞增殖；miR-124能夠抑制甲狀腺功能減退大鼠中海馬神經元凋亡，其作用機制與下調Bax和上調Bcl-2的表達有關〔20～22〕。本研究結果提示，miR-124可能通過抑制PI3K/AKT信號通路活性，上調Bax和下調Bcl-2表達誘導甲狀腺癌SW579細胞凋亡。

綜上，miR-124在甲狀腺癌的發生發展過程中發揮重要作用，過表達miR-124能夠誘導甲狀腺癌細胞凋亡，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路活性，上調Bax和下調Bcl-2表達有關。