甜菜堿聯(lián)合藻藍蛋白對肺癌細胞A549體內外增殖的影響

王碧榮 李衛(wèi)東 鄧旭斌 方盛華 王 慧

(廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤內科，廣東 廣州 510095)

肺癌發(fā)病率和死亡率都逐年升高，尤其是晚期肺癌，治療手段以化療及靶向治療為主，而目前化療藥物療效出現(xiàn)瓶頸，尋找新的化療藥物是晚期肺癌治療的熱點〔1〕。化療藥物大部分由天然植物提煉或者天然植物成分合成，因此天然植物為化療藥物做出了極大的貢獻〔2〕。藻藍蛋白是一種無副作用的天然植物營養(yǎng)物質，已經(jīng)被廣泛添加到食品中。有相關研究顯示，藻藍蛋白可以抑制體內和體外癌細胞的增殖〔3，4〕。而之前也有報道指出甜菜堿也具有抗腫瘤的效果，并且這種抗腫瘤的作用可能是通過調節(jié)基因表達和穩(wěn)定癌癥抑制基因的甲基化所介導的〔5〕。由于甜菜堿與藻藍蛋白均有無毒及抗癌作用，是否可成為新的化療藥物是當前研究焦點。關于甜菜堿和藻藍蛋白對于人肺癌細胞A549細胞周期和增殖影響的研究甚少。本研究旨在探索甜菜堿和藻藍蛋白二者單獨以及聯(lián)合使用對肺癌細胞的作用。

1 材料與方法

1.1實驗試劑 甜菜堿(≥99%)，藻藍蛋白(≥95%)(Sigma，美國)，胎牛血清(Hyclone 公司，美國)，RPMI1640 培養(yǎng)液(Gibco 公司，美國)，MTT試劑盒，蛋白提取試劑盒(Invitrogen 公司，美國)，兔抗人MAPK抗體和兔抗人β-actin抗體(Abcam，美國)。

1.2細胞株 人肺癌細胞株 A549 細胞購于中國科學院上海細胞庫。

1.3實驗動物 裸鼠〔許可證號：SCXK(粵)2013-0008〕40只，體重18～22 g，購于廣東醫(yī)科大學，于無菌培養(yǎng)室內飼養(yǎng)。

1.4實驗方法

1.4.1細胞培養(yǎng) A549細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清+1%抗生素的 1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為5% CO2，相對濕度95%，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2荷瘤裸鼠模型 無菌環(huán)境中定期喂食裸鼠滅菌好的鼠糧和水1 w后，酒精消毒裸鼠背部皮膚，開始接種制備好的A549細胞懸液(1×106/200 μl)用1 ml注射器接種于裸鼠右側背部皮下，制成人肺癌裸鼠移植瘤模型。荷瘤模型成功后(注射點無破潰紅腫，皮下結節(jié)直徑>0.5 cm為成瘤標準)，將裸鼠隨機分成4組(對照組，甜菜堿組，藻藍蛋白組，甜菜堿+藻藍蛋白組)，每組10只。無菌環(huán)境中飼養(yǎng)，游標卡尺測量腫瘤體積(TV)，30～50 mm3時開始給裸鼠喂藥，甜菜堿組裸鼠每次給10%甜菜堿0.2 ml。藻藍蛋白組每次給藥0.2 ml，劑量為100 μg/L，聯(lián)合組給10%甜菜堿+100 μg/L藻藍蛋白；對照組每天每次注射0.2 ml 生理鹽水，連續(xù)給藥3 w，1次/d，均采用腹腔注射，給藥后正常喂鼠糧和水。每周測量一次實體瘤的大小，并記錄結果。TV=0.5×長徑×(短徑)2。

1.4.3MTT實驗 取對數(shù)生長期A549細胞，每孔2×103/100 μl細胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，每孔加入不同濃度甜菜堿(0.01%、0.10%、1.00%和4.00%)或藻藍蛋白(10、20、30和40 μg/L)或對應的聯(lián)合作用組合；在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。細胞在處理完畢之后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl 充分溶解，待甲臜完全溶解后，用酶標儀(Bio-Tek，ELX800)在波長490 nm處讀取吸光度(A490)值。增殖效率=(實驗組OD值-對照組OD值)/對照組OD值。

1.4.4Western印跡試驗 A549細胞5×105/孔接種于6孔板中，待細胞長至90%左右時，分別加入4%甜菜堿，40 μg/L藻藍蛋白和4%甜菜堿+40 μg/L藻藍蛋白，對照組加入無血清1640培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24 h和48 h提取細胞蛋白，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定每組蛋白質濃度，每孔總蛋白上樣量為30 μg，上完樣后進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后轉膜(120 V，90 min)，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗滌緩沖液洗膜5 min/次，洗5次。分別加入MAPK抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶2 000)4℃孵育過夜，洗滌緩沖液洗膜5 min/次，洗5次。分別用稀釋比例為1∶1 000的羊抗兔二抗37℃搖床反應1 h，洗滌緩沖液洗膜5 min/次，洗5次。用電化學發(fā)光(ECL)試劑盒進行顯色后凝膠成像分析系統(tǒng)(中國，Tanon 5200)拍照后采用LabWorks4.6軟件進行灰度值分析。

1.4.5流式細胞術檢測細胞周期 A549細胞5×105/孔接種于6孔版中，待細胞長至90%左右時分別加入4%甜菜堿，40 μg/L藻藍蛋白和4%甜菜堿+40 μg/L藻藍蛋白，對照組加入無血清1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h用胰酶消化收集細胞1×105，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，棄上清，加入1 ml 70%預冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定12 h，PBS洗滌去乙醇，離心5 min(2 500 r/min)，洗2次。0.5 ml PBS重懸細胞，加入碘化錠(PI)和 RNaseA至終濃度50 μg/ml，37℃溫浴30 min。用流式細胞儀(BD Influx)上機測定細胞周期。

1.5統(tǒng)計學分析 應用SPSS18.0軟件，計量資料比較采用單因素方差分析、HSD-q檢驗，兩因素析因方差分析、LSD-t檢驗，重復測量資料則行重復測量方差分析、組間LSD-t檢驗、時間差值t檢驗。

2 結 果

2.1MTT檢測甜菜堿和藻藍蛋白二者單獨和聯(lián)合對肺癌細胞A549活性 隨著甜菜堿濃度的增加，肺癌細胞A549活性出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，與對照組(0)相比，甜菜堿的濃度為0.01%和0.10%時A549細胞的活性顯著增加，而4%的甜菜堿時A549細胞的活性顯著降低(均P<0.05)。藻藍蛋白作用A549細胞時，細胞的活性并沒有發(fā)生太大的變化，僅當藻藍蛋白濃度增加到最高濃度時，細胞的活性相比對照組才出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)。二者聯(lián)合使用(A：甜菜堿，B：藻藍蛋白)時細胞活性降低(AB交互作用P<0.05)。當甜菜堿的濃度為4%時，無論是單獨作用還是和藻藍蛋白聯(lián)合使用，細胞的活性亦有明顯降低(P<0.05)。見表1、表2。

2.2流式細胞儀檢測甜菜堿和藻藍蛋白二者單獨和聯(lián)合對肺癌細胞A549周期 甜菜堿組、藻藍蛋白組及兩者聯(lián)合組在G2/M期出現(xiàn)明顯細胞受阻，甜菜堿組處于G2/M期的比例為50.73%，藻藍蛋白組為17.39%，甜菜堿與藻藍蛋白聯(lián)合組為58.19%，均高于對照組的7.98%(P<0.05)。表明甜菜堿和藻藍蛋白聯(lián)合使用將A549細胞周期阻滯在G2/M期，抑制細胞增殖。見表3。

表1 甜菜堿和藻藍蛋白二者單獨對肺癌細胞A549活性的影響

1)2)3)4)分別為與A、B、C、D組比較：P<0.05

表2 甜菜堿和藻藍蛋白二者聯(lián)合對肺癌細胞A549活性的影響

表3 甜菜堿、藻藍蛋白二者單獨和聯(lián)合對肺癌細胞A549周期的影響(%,n=6)

與對照組比較：1)P<0.05

2.3Western印跡法檢測甜菜堿和藻藍蛋白對肺癌細胞A549內MAPK蛋白的表達 甜菜堿和藻藍蛋白分別和聯(lián)合作用A549細胞24 h，A549細胞內MAPK蛋白水平表達均有明顯升高(P<0.05)，而48 h MAPK蛋白水平更加顯著，其中甜菜堿和藻藍蛋白聯(lián)合作用A549細胞時，MAPK蛋白水平表達顯著升高(P<0.05)(見表4)。這表明甜菜堿和藻藍蛋白均能促進肺癌細胞株MAPK蛋白表達，從而抑制細胞株增殖。

2.4甜菜堿和藻藍蛋白二者單獨和聯(lián)合對肺癌細胞A549荷瘤鼠TV的影響 荷瘤鼠分別喂食甜菜堿和藻藍蛋白后，TV與對照組比較呈減小趨勢，同時喂食

甜菜堿和藻藍蛋白后與二者單獨作用相比，TV更趨減小。2 w時，單獨喂食甜菜堿和藻藍蛋白組，二者聯(lián)合喂食組與對照組相比，TV均明顯減小(P<0.05)。3 w時，單獨喂食甜菜堿和藻藍蛋白組，二者聯(lián)合喂食組與對照組相比，TV亦分別減小(P<0.05)。提示甜菜堿和藻藍蛋白二者聯(lián)合使用的殺瘤效果要強于單獨使用。見表5。

表4 甜菜堿和藻藍蛋白對肺癌細胞A549內MAPK蛋白表達的影響

1)2)3)分別為與A、B、C組相比：P<0.05；4)為與24 h比較：P<0.05

表5 甜菜堿和藻藍蛋白對肺癌細胞A549荷瘤鼠TV的影響

1)2)3)分別為與A、B、C組相比：P<0.05；4)為與0 w時比較：P<0.05

3 討 論

肺癌的發(fā)生發(fā)展與抑癌基因甲基化關系密切，穩(wěn)定抑癌基因的甲基化對抑制腫瘤的發(fā)生有重要意義。甜菜堿是一種高效的甲基提供者，它對于穩(wěn)定DNA甲基化的過程具有重要作用。甜菜堿廣泛存在于多種天然植物及食品中〔6〕，而體內的膽堿也可通過肝臟和腎臟氧化成甜菜堿〔7〕。同時甜菜堿細胞膜結構的完整性和信號功能，神經(jīng)傳導素的合成中起到重要作用。因此，目前甜菜堿被應用于治療心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)及內分泌系統(tǒng)疾病。而在惡性腫瘤中研究表明，甜菜堿能抑制白血病細胞株、肉瘤細胞株、乳腺癌細胞，結腸腺癌細胞，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其通過調節(jié)基因表達和抑癌基因的甲基化來抑制癌細胞的增殖〔8～11〕。在肝癌研究中，Zhou等〔6〕發(fā)現(xiàn)甜菜堿聯(lián)合膽堿可降低原發(fā)性肝癌的發(fā)生風險。在肺癌的研究中，也發(fā)現(xiàn)甜菜堿可降低其發(fā)生風險〔12〕，但目前對甜菜堿降低肺癌發(fā)生的機制未明確。藻藍蛋是藻膽蛋白家族成員之一，具有光能作用。藻膽蛋白由于其富含豐富的脂肪，維他命，微量金屬，葉綠素，β-胡蘿卜素和多糖等組分，因此是一種重要的天然植物〔13〕。有研究表明，藻藍蛋白具有抗氧化、抗突變、抗病毒，免疫刺激等多種生物學功能〔14〕。而在抗腫瘤中，Yang等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，藻藍蛋白可以抑制體外宮頸癌HeLa細胞和肺癌細胞株A459的增殖，其作用機制可能與抑制細胞周期、促進細胞凋亡及介導細胞溶解有關。

綜上所述，甜菜堿與藻藍蛋白均有抑制腫瘤細胞增殖作用，而兩者聯(lián)合作用，是否有更顯著的抑瘤作用，目前國內外研究甚少。

本研究結果顯示，甜菜堿可以有效降低肺癌細胞A549的存活率，而且隨著濃度的升高，抑制肺癌細胞株增殖越明顯，這結果與Guo等〔16〕報道的不同濃度甜菜堿處理Hela和HepG2細胞實驗結果相似。而在藻藍蛋白抑制實驗中，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高，抑制肺癌細胞增殖也有所增強，但總體上藻藍蛋白抑瘤作用不是非常明顯，這與張成等〔17〕研究藻藍蛋白在人結腸癌SW480細胞增殖的結果存在差異。當藻藍蛋白與甜菜堿聯(lián)合時，可明顯抑制了肺癌A459細胞株的生長，抑制效果比單獨使用甜菜堿或者藻藍蛋白均強，這結果與Yang等〔15〕的研究比較相似。其中一種原因可能是由于藻藍蛋白的來源不同，導致實驗結果也不同，另一種因素可能與藻藍蛋白光能作用起到協(xié)同其他藥物促進細胞凋亡相關。誘導細胞凋亡主要是通過兩種不同的細胞內通路引起，分別由死亡受體和線粒體的激活所介導，其中線粒體的介導激活與藥物或者放射治療有關，作用機制可能是藥物可激活細胞內的p38 MAPK的表達，p38 MAPK可激活線粒體的介導細胞凋亡功能，這表明它激活是藥物引起細胞凋亡的必要過程〔18〕。本實驗結果提示甜菜堿和藻藍蛋白有促進細胞內p38 MAPK蛋白的表達，從而激活線粒體功能抑制肺癌A459細胞株增殖，而且兩者聯(lián)合并且作用時間越長，表達含量越高，可能抑制肺癌細胞株增殖的功能越強。細胞周期中G1期是細胞增殖復制的起點，而G2/M期是細胞進入有絲分裂的關鍵點，這兩個時點受到抑制均可導致細胞周期復制阻塞，導致細胞凋亡，因此細胞周期的功能失調對于癌癥的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用，特別是對G1和G2/M期的調控，將成為惡性腫瘤治療的熱點。在本研究中，甜菜堿與藻藍蛋白均可導致肺癌細胞株A459細胞周期在G1期出現(xiàn)細胞比例下降，而在G2/M期出現(xiàn)細胞堆積，這表明兩者均能抑制肺癌細胞進入G1復制期和G2/M有絲分裂期，導致細胞凋亡，其中甜菜堿作用效果更加明顯，而且與濃度呈正相關。與單獨用甜菜堿組相比，聯(lián)合藻藍蛋白組中，G1期的細胞數(shù)量，而G2/M期細胞數(shù)量增多。這表明甜菜堿聯(lián)合藻藍蛋白調控肺癌細胞株作用更加顯著。本研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿和藻藍蛋白具有抑制肺癌細胞活性，抑制細胞周期增殖的作用，而兩者聯(lián)合使用時，抑制作用更加顯著，藻藍蛋白可能有協(xié)同甜菜堿作用。

體內實驗結果與Kim等〔19〕在結腸癌腫瘤鼠模型中結果相似，表明甜菜堿可以明顯抑制ROS的產(chǎn)生并且降低氧化型谷胱甘肽的濃度，從而起到抗氧化作用而抑制腫瘤生長。藻藍蛋白作為富含半胱氨酸/甲硫氨酸的蛋白質可以通過調節(jié)pH來影響甜菜堿的吸收，而且可以通過激活線粒體功能誘導細胞凋亡，殺傷腫瘤細胞，因此，甜菜堿與藻藍蛋白在體內研究中也存在著協(xié)同作用。本研究結果顯示：甜菜堿與藻藍蛋白在體內也可以抑制肺癌細胞增殖，導致腫瘤縮小。

綜上所述，藻藍蛋白和甜菜堿在體內外均能抑制肺癌細胞增殖，而且兩者聯(lián)合時作用更加明顯，該結果雖然未能完全闡明兩者聯(lián)合對肺癌細胞的作用機制，但為探索甜菜堿和藻藍蛋白是否能成為新的抗腫瘤藥物提供了實驗基礎。