苗藥飛龍掌血抗大鼠急性痛風性關節炎的作用

田培燕 余躍生 鄧祖國 陳應康 祝 星

(黔南民族醫學高等?？茖W校，貴州 都勻 558000)

飛龍掌血是蕓香科飛龍掌血屬(Toddalia)植物飛龍掌血的根或根皮，全年可采挖。飛龍掌血最早收載于《植物名實圖考》，味苦，性冷，具有消腫解毒，祛風除濕的功效。在我國主要分布在貴州、云南和四川等西南省份，是典型的苗族藥物〔1，2〕。苗族民間將飛龍掌血的根或根皮的水煎液或藥酒治療跌打損傷和風濕性關節炎，動物研究也顯示飛龍掌血具有明顯的鎮痛抗炎活性〔3，4〕。急性痛風性關節炎(AGA)的臨床癥狀在于關節處紅、腫、熱和痛，嚴重者可致關節變形，臨床常用糖皮質激素或秋水仙堿緩解其癥狀，但這兩類藥物容易引發嚴重不良反應，甚至導致炎癥復發〔5〕。本文探討飛龍掌血對鼠AGA治療作用及可能機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 SPF級大鼠80只，體質量180～220 g，雌雄各半，購于重慶騰鑫生物技術有限公司，合格證號：SCXK(瑜)〔2007-0006〕。

1.2受試藥 飛龍掌血購于遵義市中藥材批發市場。由黔南民族醫專魏學軍教授鑒定為飛龍掌血干燥根。取干燥至恒重的飛龍掌血藥材1 kg，采用70%乙醇溶液進行提取，回流提取2次，每次溶劑的體積為所用藥材的12、10倍，分別提取2、1 h，合并2次提取液，減壓過濾。秋水仙堿(云南省玉溪望子隆生物制藥有限公司，國藥準字：H53021904，規格：0.5 mg/片)。

1.3儀器與試劑 N4紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；DB027型鼠尾光照測痛儀(北京智鼠多寶生物科技有限責任公司)。尿酸晶體(美國Sigma公司)、白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒均購自貴州明涵生物科技有限公司。

1.4制備AGA大鼠模型 將大鼠固定于自制大鼠架上，暴露右側踝關節，依次采用碘伏及醫用酒精消毒皮膚表面，以45°在大鼠右側踝關節背側插至脛跗關節腔，緩慢注射(5%)尿酸鈉0.1 ml。

1.5分組和給藥 將AGA大鼠隨機分為5個組：模型組、秋水仙堿組(0.3 mg/kg)、飛龍掌血低、中、高劑量組(1、2、4 g/kg)，將正常大鼠同樣部位注射0.9%氯化鈉注射液0.1 ml為對照組，所有組別灌胃給藥，對照和模型組給予生理鹽水，給藥體積20 ml/kg，1次/d，10只/組，連續給藥10 d。

1.6步態評分 給藥1、5、10 d對步態進行評分：0分：行走正常；2分：輕微跛行，右下肢微彎；4分：中度跛行，右下肢剛可觸地面，6分：重度跛行，僅能3足行走，右下肢難以觸及地面。分數越高，步態越差。

1.7足趾腫脹體積 給藥1、5、10 d測量大鼠踝關節體積，采用自制足趾腫脹體積裝置測量大鼠右后肢踝關節體積。

1.8痛閾 給藥1、5、10 d記錄動物痛閾。在20℃環境下，固定大鼠，采用鼠尾光照測痛儀，使大鼠雙后肢暴露在燈下，雙后肢距燈約3 cm，記錄自照射至大鼠縮腿反應的時間。

1.9外周血炎癥因子 給藥結束后2 h，斷尾法取血，離心得血清，采用酶聯免疫吸附檢測(ELISA)，嚴格按照試劑盒說明檢測血清的IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.10逆轉錄聚合酶鏈反應檢測關節滑膜組織NF-κBp6表達 給藥結束，處死大鼠，切開大鼠膝關節前側髕前韌帶髕骨下緣，分離髕下脂肪墊，得到關節滑膜，用10%甲醛溶液固定48 h，制作病理切片，行免疫組化染色。

1.11關節滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達 RNA提取 于10 d給藥后2.5 h，處死大鼠，游離大鼠右后肢關節滑膜組織，稱取50 mg，液氮研磨，加1 ml TRIzol 勻漿，離心去除未裂解組織。加0.2 ml氯仿，振蕩均勻，離心取上清。加0.5 ml 異丙醇，離心去上清。加1 ml 75%乙醇，離心去上清，干燥得RNA。加 25 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水，-80℃備用。PCR反應在EP管中，加入3 μg總RNA、1 μl 10 μmol/L Oligo，以DEPC水補至 12 μl。PCR儀上65℃加熱5 min，冰浴3 min。在EP管加4.0 μl 5×反應緩沖液、2 μl 10 mmol/L dNTP混合物、1 μl反式TM M-Mu LV反滲透液和1 μl RNA酶抑制劑，70℃ 5 min，得cDNA。取1 μl cDNA為熒光定量模板，反應體系：5 μl 2×核酸染料，1 μl 10 μmol/L正向引物，1 μl模板DNA，1 μl 10 μmol/L反向引物和2 μl無RNA酶水。95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 30 s，40個循環，GAPDH為內參。IL-1β、IL-6和TNF-α序列見表1。

表1 IL-1β、IL-6和TNF-α的序列

1.12大鼠關節滑膜組織 NF-κBp65 的表達于10 d給藥后，取患肢的滑膜組織，并制成石蠟切片，滴加正常山羊血清封閉液，滴加Ι抗 PBS 50 μl/片，4℃過夜，在 37℃復溫10 min，PBS洗滌，滴加Ⅱ抗PBS 50 μl/片，37℃ 30 min，PBS洗滌，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，鏡下查看。

1.13統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行F、t檢驗。

2 結 果

2.1各組步態評分比較 與對照組比較，造模后1、5、10 d模型組步態評分明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，飛龍掌血各組及秋水仙堿組步態評分均有不同程度降低(P<0.05)，呈時間-劑量依賴性關系，見表2。

2.2各組足趾腫脹體積比較 與對照組比較，造模后1、5、10 d模型組足趾腫脹體積明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，飛龍掌血各組、秋水仙堿組足趾腫脹體積均有不同程度降低(P<0.05)，呈時間-劑量依賴性關系，見表3。

表2 各組步態評分比較(n=10，分，

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與低劑量組比較：3)P<0.05；與中劑量組比較：4)P<0.05；與1 d比較：5)P<0.05；下表同

表3 各組足趾腫脹體積比較

2.3各組痛閾比較 與對照組比較，造模后1、5、10 d模型組痛閾明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，飛龍掌血各組、秋水仙堿組痛閾均有不同程度增高(P<0.05)，呈劑量依賴性關系，見表4。

2.4各組外周血IL-1β、IL-6和TNF-α、關節滑膜組織NF-κBp65比較 與對照組比較，模型組外周血炎癥因子和關節滑膜組織NF-κBp65明顯增高(P<0.05);與模型組比較，飛龍掌血各組、秋水仙堿組外周血炎癥因子和關節滑膜組織NF-κBp65均有不同程度降低(P<0.05)，呈劑量依賴性關系，見表5和圖1。

表4 各組痛閾比較

表5 各組外周血IL-1β、IL-6和TNF-α、關節滑膜組織NF-κBp65表達比較

圖1 各組關節滑膜組織NF-κBp65表達(免疫組化，×200)

2.5各組關節滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表達比較 與對照組比較，模型組關節滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，飛龍掌血各組及秋水仙堿組關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA均有不同程度降低(P<0.05)，呈劑量依賴性關系，見圖2和表6。

1.對照組，2.模型組，3.飛龍掌血低劑量組，4.飛龍掌血中劑量組，5.飛龍掌血高劑量組，6.秋水仙堿組圖2 各組關節滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達

組別IL-1βIL-6TNF-α對照組0.21±0.110.21±0.110.22±0.12模型組1.02±0.221)1.21±0.531)0.81±0.241)飛龍掌血低劑量組0.71±0.212)0.71±0.352)0.64±0.26飛龍掌血中劑量組0.72±0.202)0.62±0.342)0.52±0.372)飛龍掌血高劑量組0.61±0.302)0.31±0.152)3)0.41±0.152)3)秋水仙堿組0.42±0.112)0.24±0.132)3)0.37±0.182)3)F/P值19.826/0.00015.469/0.0007.943/0.000

3 討 論

痛風以高尿酸血癥為特點，發作突然，引起急性痛風性關節炎，疼痛難忍而就醫治療，嚴重影響了患者的生活質量〔6，7〕。痛風急性發作期治療主要在于減輕及改善患者的腫脹和疼痛癥狀，西醫主要采用糖皮質激素或秋水仙堿等藥物治療，雖然能有效地緩解疼痛癥狀，但對肝、腎及胃腸均有感染而引起不良反應，其中秋水仙堿存在明顯的腎臟及骨髓毒性，對反復發作的痛風性關節炎或伴有腎功能不全的患者限制使用。

我國苗族應用飛龍掌血在治療風濕痹痛均有一定療效。本課題顯示，飛龍掌血能夠改善AGA大鼠步態評分及足趾腫脹體積，可見飛龍掌血可用于治療AGA作用與飛龍掌血的有效成分密切相關〔8～12〕。飛龍掌血生物總堿、水提液和醇提液均具有明顯的抗炎作用，飛龍掌血的水、醇提取物均能緩解醋酸所致小鼠疼痛，且鎮痛作用相當或超過鹽酸哌替啶，原因在于飛龍掌血的水和醇提物可增加腦的β-內啡肽蛋白表達實現的，β-EP是體內產生的一類具有類似嗎啡作用的內源性肽類物質。

NF-κB信號是人體免疫系統抵抗微生物病原體的重要機制，TNF受體相關因子6可參與多條信號轉導通路，形成受體連接蛋白復合物并激活NF-κB誘導激酶，暴露NF-κB的核定位信號，進而上調炎癥因子表達，如IL-1β。上調的IL-1β可迅速活化血管內皮細胞表達細胞黏附分子，誘導粒細胞及巨噬細胞，刺激單核-巨噬細胞加快合成IL-6與TNF-α。IL-1β作為炎癥趨化因子和激活因子，存在于關節組織中最經典的炎癥細胞，在痛風性關節炎的發生、發展過程中發揮關鍵作用〔13〕。本課題提示AGA鼠的NF-κB信號通路處于激活狀態。飛龍掌血可干預NF-κB信號通路，類似的文獻也有報道〔14～16〕，如飛龍掌血提取物及所含的呋喃型香豆素、異戊烯基的簡單香豆素、苯并菲唆類生物堿和呋喃喹啉類生物堿均可顯著降低脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞產生的炎癥因子IL-6和TNF-α水平，飛龍掌血提取物可抑制關節炎各種細胞中NF-κB的轉錄水平，調節細胞對炎性介質的釋放并抑制與炎癥相關酶的活性和表達，參與類風濕關節炎的免疫細胞的增殖及活化。

綜上，苗藥飛龍掌血具有治療AGA的作用，與降低外周血IL-1β、IL-6和TNF-α及關節滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA及 NF-κBp65有關，這些藥理機制與飛龍掌血的化學成分有關。