缺氧誘導因子-1α、葡萄糖轉運蛋白-1和血管內皮生長因子水平與糖尿病大鼠血糖血脂的相關性

符 杰 馮 俊 張 雨 廖麗婭 胡嫚麗 鄧紅艷

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市普愛醫院內分泌科，湖北 武漢 430033)

糖尿病視網膜病變是糖尿病發病基礎上的高負荷血糖對于動脈血管內皮的長期損傷，視網膜動脈的長期過氧化損傷可以促進局部出血、鈣化及黃斑水腫等的形成，進而導致視力的減退和最終致盲，臨床預后較差。糖尿病視網膜病變基礎病因的探討中發現，血管內皮生長因子(VEGF)具有重要作用，長期高血糖導致的視網膜損害刺激新生血管生長，新生血管生長可引起視網膜纖維增生，超過15%的患者還可發生視網膜脫離，進而導致急性視力減退〔1，2〕。相關研究也證實，早期通過抑制VEGF能夠有效降低疾病的進展率，并能夠在病理水平改善出血斑點、硬性滲出等〔3，4〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α、葡萄糖轉運蛋白(Glut)-1能夠誘導缺氧狀態，并改變局部視網膜血管內皮細胞的代謝環境，進而促進VEGF上調，促進視網膜病變發展〔5，6〕。本研究探討 HIF-1α、Glut-1和VEGF與糖尿病大鼠血糖血脂的相關性。

1 材料和方法

1.1分組 雄性SD大鼠30只，體重190～210 g，平均體重(193.2±2.3)g，精心飼養3 d，隨機分為實驗組20只和對照組10只。大鼠均在相同條件下飼養，購自江蘇省動物實驗中心。

1.2實驗試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購自南京凱基生物科技有限公司，HIF-1α、Glut-1一抗體(兔來源，均購自羅氏檢測公司)，VEGF抗體(羊來源，購自美國Abcum公司)，二氨基聯苯胺(DAB)檢測試劑盒購自上海精密儀器有限公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗購自南京碧云天生物科技有限公司。

1.3糖尿病大鼠建模 實驗組于實驗前禁食24 h，腹腔注射4%水合氯醛280 μl/kg麻醉，固定在動物手術臺，腹腔注射50 mg/kg STZ。所有大鼠單籠喂養，定量飲水與普通喂食飼養2 w。血糖水平>11.1 mol/L，體重明顯降低，提示糖尿病大鼠制備成功。

1.4免疫組化染色法檢測視網膜HIF-1α、Glut-1和VEGF的表達 10 g/L戊巴比妥鈉腹腔內注射，采用0.5 mol/L的多聚甲醛灌流固定，石蠟切片，多聚賴氨酸處理。將切片置于60℃恒溫箱烘烤1 h，用二甲苯連續兩次浸泡10 min，水化后修復抗原，3%H2O2-甲醇溶液處理15 min，加HIF-1α、Glut-1和VEGF鼠單抗100 μl，37℃孵育1.0 h，加增強劑50 μl，室溫孵育20 min，加HRP標記二抗50 μl，室溫孵育30 min，DAB顯色，鏡下觀察。

1.5觀察指標及檢測方法 對比兩組視網膜組織細胞免疫組化染色結果，判定標準，細胞內棕色或棕黃色顆粒則為蛋白陽性反應，HIF-1α蛋白主要在胞質和胞核表達，VEGF和Glut-1蛋白主要在胞質表達。染色強度+陽性細胞率評分，包括陰性：0分；弱陽性：1分；中度：2分；強陽性：3分。陽性細胞率分級包括0分：≤5%；1分：6%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：>75%。染色強度×陽性細胞率評分≥1分，判定為蛋白陽性表達。檢測兩組三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、肌酐(Cr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血紅蛋白(Hb)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、空腹血糖(FPG)、空腹血胰島素(FINS)、穩態模式評估法測定胰島素抵抗指數(HOMA-IR)。門靜脈采血5 ml 3 000 r/min離心15 min，取上清液冷凍保存待測，將血清置于Eppendorf 管中，-80℃超低溫冰箱保存，采用全自動生化儀成批檢測血糖和血脂水平。試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。

1.6統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行t檢驗，相關性分析采用Spearman檢驗。

2 結 果

2.1兩組視網膜HIF-1α、Glut-1和VEGF表達 兩組視網膜組織內均有HIF-1α、Glut-1和VEGF的表達，見圖1。實驗組HIF-1α、Glut-1和VEGF的表達水平顯著高于對照組(P<0.01)，見表1。

圖1 兩組HIF-1α、Glut-1和VEGF蛋白在視網膜組織中表達(DAB,×400)

組別nHIF-1α (pg/ml)Glut-1(pg/ml)VEGF(pg/ml)實驗組20752.4±368.0479.4±221.349.3±15.9對照組10594.0±177.9268.8±120.727.0±14.1t值9.8579.74210.202P值0.007 50.008 20.004 8

2.2兩組血清相關指標比較 兩組TG、TC、LDL-C、HDL-C、FBG、FINS、HbA1c和HOMA-IR檢測值差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3HIF-1α、Glut-1和VEGF與糖尿病大鼠血糖血脂的相關性 糖尿病大鼠視網膜組織內HIF-1α、Glut-1與血脂血糖指標呈正相關(除與HDL-C呈負相關)(均P<0.05)，VEGF與血脂和血糖(除HbA1c、FINS外)呈正相關(P<0.05)，與HDL-C呈負相關(P<0.05)，見表3。

表2 兩組血糖和血脂指標對比

表3 HIF-1α、Glut-1和VEGF與糖尿病大鼠血糖血脂的相關性

3 討 論

視網膜病變是具有特異性改變的眼底病變，為糖尿病性微血管病變中最集中的體現。主要病理改變為動脈瘤、出血斑點、硬性滲出、棉絨斑、靜脈串珠狀及繼發性視網膜剝脫等。在糖尿病導致的局部動脈血管的高血糖環境中，血管內皮細胞的氧化應激及三磷酸腺苷(ATP)能量利用障礙更為明顯，局部視網膜基底膜長期處于缺氧狀態，在白細胞介素(IL)-6及IL-8等炎癥因子的誘導下可反饋性促進VEGF的生成〔7，8〕，擾亂內皮細胞功能，促進視網膜細胞缺血缺氧，導致視網膜發生水腫、滲出及增生等病理改變。新生毛細血管的供血功能明顯減弱，同時新生血管分布較亂，常常侵犯玻璃體，導致局部滲漏和玻璃體剝離出血。 朱麗等〔9，10〕實驗證實，在抑制VEGF的基礎上，重度視網膜病變的發生率可下降15%左右，且疾病進展率可下降20%，具有明顯的效果，這些均提示了VEGF在糖尿病視網膜病變發展中的作用。HIF-1α具有轉錄活性的核蛋白，在缺氧適應、炎癥發展等方面發揮了重要作用，其可以通過刺激末端缺氧信號的活性調控區域(富含脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸)，進而促進局部細胞代謝的低氧和應激基礎〔11，12〕；Glut-1可以介導葡萄糖的易化擴散進而轉運葡萄糖進入血-視網膜屏障內皮細胞，相關研究證實隨著視網膜病變的進展，Glut-1表達也明顯增加，特別是高表達的Glut-1可以導致轉運進入內皮細胞中的葡萄糖濃度增加，從而導致視網膜破壞〔13〕。

TG、TC和LDL-C等血脂指標是糖尿病發生發展的獨立危險因素，本研究表明糖尿病大鼠體內存在明顯的血脂代謝紊亂，長期的血脂紊亂可以進一步促進糖尿病視網膜病變的發展，增加視網膜病變基礎上的視盤新生血管、視網膜前出血及牽拉性視網膜脫離等的發生率。VEGF上調可以促進新生血管的形成及局部視網膜基底層的纖維化，視網膜間質成分代償性增生，同時VEGF可進一步促進新生血管對于玻璃體的侵襲，進一步導致玻璃體出血和增殖性視網膜病變的發生。而HIF-1α和Glut-1上調可能在這一過程中起到了重要促進作用，Glut-1上調導致的經過血-視網膜內皮細胞的葡萄糖濃度明顯增加，而機體又缺乏有效的代償機制，從而促進視網膜血管內皮的損傷。Ulas等〔14，15〕認為，HIF-1α和Glut-1可以通過影響局部能量代謝、增強局部缺氧環境，進而促進VEGF上調，并通過糖尿病大鼠造模實驗證實，HIF-1α和Glut-1水平平均上升15%和25%，這與本次研究結論較為相似。