CaMKⅡδ慢病毒過表達載體構建及其對破骨細胞分化的影響

張艷波 戚孟春 董偉 張廣峰 馮曉潔 溫黎明 孫紅

華北理工大學1口腔醫學院口腔頜面外科教研室，2基礎醫學院病理教研室（河北唐山 063000）

破骨細胞是體內唯一骨吸收的細胞，與許多疾病的骨吸收有關［1?3］?；罨疶細胞核因子c1（nuclear factor of activated T cells cytoplasmic 1，Ca2+/Calmodulin/NFATc1）信號通路在破骨細胞分化中發揮著重要作用；而鈣離子/鈣調蛋白依賴性激酶（Ca2+/Calmodulin dependent kinases，CaMKs）是鈣信號軸中傳遞鈣信號的重要分子［4?6］。研究顯示，CaMKII作為CaMKs家族中成員，其δ亞型（CaM?KIIδ）在破骨細胞分化過程中持續高表達［7?8］，提示其可能發揮關鍵作用，但其作用及機制目前尚不清楚。本實驗通過構建小鼠CaMKIIδ過表達慢病毒載體，探索其過表達對破骨細胞分化及骨吸收的影響，以進一步揭示CaMKIIδ在破骨細胞分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 RAW264.7細胞（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞），購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；小鼠核因子κB受體激活蛋白配體（receptor activatior of nuclear factor κB ligand，RANKL），美國Peprotech公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清，以色列Biological industries公司；TRAP染色試劑盒，美國Sigma公司；CaMKIIδ抗體，美國Santa cruz公司；反轉錄試劑盒及PCR試劑盒，日本TAKARA公司；引物由上海生工公司合成。

1.2 破骨細胞分化中CaMKIIδ高轉錄本的篩選經GeneBank檢索，小鼠CaMKIIδ共有7個轉錄本；為了確定過表達載體所采用的序列，針對上述7個轉錄本設計引物（表1），通過RT?PCR確定在破骨細胞分中高表達的轉錄本，用于過表達載體構建。

RAW264.7細胞以2×104個/cm2密度接種于60 mm培養皿中，24 h后加入50 ng/mL RANKL向破骨細胞誘導；于誘導第0、1、3、5 d收獲細胞，Trizol提取總RNA，逆轉錄合成cDNA；PCR擴增；反應條件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72℃ 1 min，30個循環；72℃ 10 min；擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 CaMKIIδ基因7種轉錄本引物設計Tab.1 Primers of different transcription variants of CaMKIIδ used in RT?PCR

1.3 CaMKIIδ重組載體構建 針對實驗1.2中篩選出的CaMKIIδ高表達轉錄本（轉錄本2），應用攜帶增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的慢病毒進行過表達載體構建。在最佳MOI（multiplicity of infec?tion）=30［9］條件下應用空載體及重組載體分別轉染RAW264.7細胞，72 h后用4 μg/mL嘌呤霉素篩選穩定轉染細胞株，共處理4 d。

1.4 重組CaMKIIδ在細胞中的表達檢測 RAW 264.7細胞分為三組：對照組、空載體組、CaMKIIδ過表達組。對照組細胞不轉染；后兩組分別為轉染空載體及重組載體的第三代穩定轉染細胞株；細胞培養3 d后進行檢測。

Real?time PCR 檢測：Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA；在QuantStudioTM6 Flex實時熒光定量PCR儀上檢測；反應條件：95℃3 min；95℃15 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，共40個循環。所用引物為：CaMKIIδ轉錄本 2，上游 5′?CAGTGGTGAGAA?GATGTATG?3′，下游5′?TTCAAGAGACGGCAGATT?3′，產物130 bp；β?actin，上游5′?GACGTTGACATC?CGTAAA?3′，下游 5′?AGCAGTAATCTCCTTCTG?3?，產物102 bp。

Western blot檢測：提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度；5×蛋白上樣緩沖液稀釋，煮沸、變性、轉膜；5%脫脂牛奶封閉1 h；兔抗鼠一抗4℃過夜，羊抗兔二抗37 ℃ 0.5 h，ECL（Enhanced chemiluminescence）顯色1 min。經Image?pro plus 6.0軟件分析蛋白條帶積分光密度值（IOD）；以β?actin為內參。目的蛋白條帶IOD值與β?actin條帶IOD值的比值代表目的蛋白相對水平；實驗重復3次。

1.5 CaMKIIδ過表達對破骨細胞分化及功能的影響 實驗分組同實驗1.4。細胞接種同實驗1.2，采用100 ng/mL RANKL進行誘導分化。TRAP染色：誘導5 d后，收獲細胞并按照試劑盒說明書進行TRAP染色，200倍顯微鏡下觀察。每張細胞爬片隨機取6個視野，計算TRAP+且胞核≥3個的細胞數目，取其平均值；每組測量5個細胞爬片［10］。吸收陷窩檢測：制備0.2 mm厚牙本質磨片并接種細胞；誘導14 d后收獲細胞，500倍下掃描電鏡（SEM）選取6個視野，檢測每個視野吸收陷窩數目及面積，取平均值；每組檢測5個質磨片［10］。

1.6 統計學方法 定量數據用均數±標準差表示。使用SPSS 17.0軟件對各組參數進行單因素方差分析；P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CaMKIIδ高表達轉錄本篩選 破骨細胞分化不同時間點CaMKIIδ各轉錄本PCR產物電泳條帶見圖1。條帶1、9、13分別代表轉錄本1、5、7，有微弱條帶出現，提示這3個轉錄本表達較弱；條帶7、11分別代表轉錄本4、6，無條帶出現，提示無表達；條帶3、5分別代表轉錄本2、3，條帶較亮，提示高表達。由于轉錄本2引物還能擴增轉錄本6，轉錄本3的引物還能擴增轉錄本2和6（表1），其中轉錄本6不表達，提示條帶3中均是轉錄本2，而條帶5中除轉錄本3外還含有轉錄本2，即在破骨細胞分化中只有轉錄本2、3高表達。

2.2 CaMKIIδ過表達載體構建 應用攜帶綠色熒光蛋白的慢病毒過表達載體和空載體分別轉染RAW264.7細胞，經嘌呤霉素篩選，可見幾乎全部細胞都帶有綠色熒光標記（圖2），建立了穩定轉染細胞株。

2.3 重組CaMKIIδ在細胞中的表達 Real?time PCR檢測：過表達組CaMKIIδ mRNA水平為2.176±0.266，顯著高于對照組的0.955±0.199和空載體組的1.172±0.118（P＜0.05），分別升高了107.8%和85.7%；提示重組CaMKIIδ mRNA在RAW264.7細胞中得到了有效表達。

Western?blot檢測見圖3：過表達組CaMKIIδ蛋白條帶IOD比值為0.958±0.087，顯著高于對照組的0.698±0.017（P＜0.05）和空載體組的0.699±0.077（P＜0.05），分別上升了37.2%和37.1%；而空載體組與對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）；提示重組CaMKIIδ蛋白在RAW264.7細胞中得到了有效表達。

圖1 破骨細胞分化第0、1、3、5 d CaMKIIδ各轉錄本表達情況Fig.1 Detection of different transcript variants of CaMKIIδ at day 0，1，3，5 during osteoclast differentiation

圖2 慢病毒穩定轉染株篩選（熒光倒置顯微鏡，×200）Fig.2 Screening of RAW264.7 cells stably infected by lentivirus（fluorescent inverted microscope，× 200）

2.4 CaMKIIδ過表達對破骨細胞分化及功能的影響 TRAP染色顯示三組經誘導后均出現TRAP+多核細胞（圖4）；其中過表達組破骨細胞數目為（22.8±5.1）個，與對照組的（23.8±4.3）個和空載體組的（21.2±2.5）個比較差異無統計學意義（P＞0.05）。掃描電鏡（SEM）可見（圖4），三組細胞在牙本質磨片上均有吸收陷窩形成；過表達組吸收陷窩數、吸收陷窩面積分別為（2.4±0.9）個和（1 262.720± 477.855）μm2，與對照組［（2.4± 0.5）個和（1 165.200± 572.415）μm2］和空載體組［（2.8±0.8）個和（1 143.760 ± 392.864）μm2］比較差異無統計學意義（P＞0.05）。上述結果提示，CaMKIIδ過表達對破骨細胞分化及骨吸收功能無顯著影響。

圖3 Western?blot檢測三組細胞CaMKIIδ蛋白水平Fig.3 Detection of CaMKIIδ protein level among three groups by western?blot

3 討論

破骨細胞分化或活性增強會引起過度骨吸收，從而導致骨質疏松癥、關節炎、牙周炎和骨腫瘤等疾病的發生［1?3］；因而破骨細胞分化調控研究對上述疾病治療有重要意義。

Ca2+/Calmodulin/NFATc1信號軸對破骨細胞分化至關重要；在該信號軸中，CaMKs是傳遞鈣信號的重要分子。研究發現，CaMKII和CaMKIV在破骨細胞分化中發揮主要作用［4?5，11?13］。CaMKIV 可以通過CREB信號調控破骨細胞分化［13］；而PARK?MIN［14］及 WILLIAM 等［15］研究發現，RANKL 刺激可使破骨細胞分化中CaMKII磷酸化，顯著提高其蛋白活性；但CaMKII發揮的作用目前還遠未弄清。

CaMKII有α、β、γ、δ四個異構體；國外學者及我們前期研究發現，CaMKIIδ在破骨細胞分化中表達最高，且隨時間表達逐步增強［7?8］，提示其作用可能極為關鍵。CHANG等［11］研究顯示，CaMKIIδ基因敲除及抑制劑KN93處理，均可使TRAP+破骨細胞前體百分比顯著下降，并破骨細胞前體逆轉成TRAP陰性細胞；本團隊研究發現，CaMKIIδ RNA干擾不僅抑制多核破骨細胞生成，而且顯著下調破骨細胞分化相關因子NFATc1、TRAP、非受體酪氨酸激酶（c?Src）的基因表達［9］；因而推斷CaMKIIδ在破骨細胞分化信號調控中發揮著重要作用。

小鼠CaMKIIδ由于mRNA不同剪切，共有7個轉錄本。在破骨細胞分化調控中，是否這些轉錄本均參與其中呢？為了解決這個問題，本研究通過設計特異性引物，對破骨細胞分化過程中CaM?KIIδ 7個轉錄本的表達情況進行檢測。結果發現，只有轉錄本2和3高表達，轉錄本1、5、7表達較弱，而錄本4、6則無表達。上述結果提示，CaMKIIδ轉錄本2和3可能在破骨細胞分化調控中發揮著關鍵作用。上述發現國內外尚無文獻報道。

為了進一步證實CaMKIIδ在破骨細胞分化中的作用，本研究篩選并構建了CaMKIIδ轉錄本2的基因重組載體，以探討其過表達是否會促進破骨細胞分化。結果發現，重組CaMKIIδ在破骨細胞中得到有效表達，說明重組載體構建是成功的；然而，在RANKL誘導的破骨細胞分化中，過表達組中破骨細胞數目、牙本質吸收陷窩數與吸收陷窩面積與對照組和空載體組并無明顯差異，說明CaMKIIδ過表達對破骨細胞生成和功能無明顯影響。

上述結果似乎與CHANG等［11］及我們前期研究［9］結論相矛盾；分析原因，這可能與破骨細胞分化中所需CaMKII信號水平有關。破骨細胞分化離不開 CaMKIIδ 的信號刺激［7，9，11］，因而 CaMKIIδ隨著破骨細胞分化而逐漸表達增強［7-8］；但細胞分化所需CaMKIIδ的量可能是一定的，過多的超出生理水平的CaMKIIδ并不能促進破骨細胞分化；或者破骨細胞內存在負反饋信號系統，過高水平的CaMKIIδ被其他信號分子的作用所抵消。然而，上述解釋是否正確？哪些負反饋系統可能參與CaMKIIδ的負反饋？有待于進一步研究證實。