中藥骨蝕靈膠囊對早期兔激素性股骨頭壞死的干預作用

范武 于雪峰 任向楠 陳凱云

1南昌大學（南昌 330003）；2南昌大學第四附屬醫院（南昌 330003）；3清華大學生命有機磷化學及化學生物學教育部重點實驗室（北京100084）

臨床上部分患者因自身免疫性疾病等需要長期或過量使用糖皮質激素，導致激素性股骨頭壞死（steroid?associated necrosis of the femoral herd，SANFH）的患病人數不斷增加，嚴重影響患者的生存質量。目前關于SANFH的發病機制尚未明確，但有研究表明［1-3］脂質代謝紊亂為其發病的重要環節，過量激素的使用會造成大量的脂肪分解產物被釋放進入血液循環，引起機體內血脂水平升高，血液變得黏稠，導致髓內的微型血管出現栓塞［4-5］，同時會誘導脂肪細胞堆積在髓腔，壓迫腔內血管，造成股骨頭缺血壞死［2，6］。中醫學認為股骨頭壞死當屬“骨痹”“骨蝕”“血瘀”等范疇，其主要病因為瘀血阻滯、經脈不通，因此臨床上常應用活血化瘀、補腎壯骨的方法治療股骨頭壞死，療效確切，但有關激素誘發股骨頭壞死的早期中藥預防作用及機制的報道較少。本實驗通過建立激素誘導的兔股骨頭壞死模型，運用具有活血補氣、補腎壯骨功效的中藥復方骨蝕靈膠囊進行干預治療，觀察動物模型中的血脂水平改變特點及股骨頭組織形態影像學變化，探究其可能的預防股骨頭壞死的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年健康日本大耳白兔48只，體質量為（2.5± 0.3）kg，雌雄各半，實驗兔子單獨分籠、顆粒飼料喂養，由清華大學動物實驗中心提供并在此完成實驗，環境溫度為20～25℃，明暗周期12 h/12 h。

1.2 藥物及試劑 藥物：骨蝕靈膠囊，0.27 g/粒，購于黑龍江中醫藥大學制藥廠；醋酸潑尼松龍，125 mg/5 mL，購于浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H33020824；洛伐他汀片，20 mg/片，購于北京萬生藥業有限責任公司，國藥準字H10970092；青霉素鈉，80萬U/支，購于華北制藥股份有限公司，國藥準字H13020657。試劑：2700全自動生化分析儀Olympus配套的生化檢測試劑。

1.3 分組 48只實驗兔，耳緣靜脈采血后血清血脂生化檢查差異無統計學意義（P＞0.05）。適應性喂養1周后隨機分成4組：對照組、模型組、骨蝕靈膠囊組、洛伐他汀組，每組12只。

1.4 造模和干預方法

1.4.1 造模 對照組在左側臀部肌肉注射生理鹽水，1 mL/只，每周2次，連續4周。其余3組每只兔子均在左側臀部肌肉注射醋酸潑尼松龍注射液（10 mg/kg），1 mL/只，每周2次，連續4周。

1.4.2 干預方法 對照組：蒸餾水空腹灌胃15 mL，每日1次，連續4周。模型組：蒸餾水空腹灌胃15 mL，每日1次，連續4周。骨蝕靈膠囊組：骨蝕靈膠囊粉末，用蒸餾水調成90 mg/mL濃度的混懸液15 mL，空腹灌胃，每日1次，連續4周。洛伐他汀組：洛伐他汀片，磨成粉末后用蒸餾水調成200 μg/mL濃度的混懸液，15 mL，空腹灌胃，每日1次，連續4周。藥物使用量均按人與兔體表面積換算公式計算。

1.5 主要設備和儀器 2700全自動生化分析儀：Olympus；200倍光學顯微鏡：Olympus；磁共振掃描儀：Philips 3.0T Achieve TX。

1.6 血清脂質生化檢查 分別在第2、4周時間節點，各組均使用采血管從動物同一部位的耳緣靜脈采血3 mL，室溫靜置4 h后離心（4 000 r/min，時間10 min），取上清液并使用全自動生化分析儀測定各組的總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）的血清水平。

1.7 MRI檢查 第4周，各組選取2只兔子在核磁檢測前用1%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）靜脈注射使動物鎮靜，核磁成像在清華大學生物影像中心完成，使用Philips 3.0T Achieve TX儀器進行雙側股骨頭核磁掃描成像。

1.8 股骨頭形態學檢查 分別在第2、4周時間節點各組隨機選取3只兔子，使用20 mL注射器進行空氣栓塞法處死后，迅速取出雙側股骨頭組織，在清潔干凈的冰浴手術盤中用生理鹽水進行沖洗干凈，放入10%福爾馬林溶液中固定脫鈣，按照蘇木精-伊紅染色（HE）染色切片要求浸蠟包埋并切片觀察。

1.9 統計學方法 使用SPSS 21.0統計學軟件對本次實驗中獲得的血清脂質水平數據進行統計分析，總體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，并使用Graph Pad Prism 5進行作圖。

2 結果

2.1 第2周和第4周時各組的血清脂質檢測結果 生化檢測結果發現，與對照組相比，其余3組在第2周時的血清脂質均出現明顯代謝紊亂，差異均有統計學意義（P＜0.01）；第4周時，與模型組相比，骨蝕靈膠囊組和洛伐他汀組的TC、TG以及LDL水平明顯降低，且差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1、2。

表1 2周時各組兔血清TC、TG、HDL、LDL水平比較Tab.1 The levels of TC，TG，HDL，LDL in each group at 2 weeks（n=12） x ± s，mmol/L

2.2 各組兔股骨頭HE染色的光鏡檢查結果 4周對照組：空骨陷窩少，骨小梁粗大完整，未見排列紊亂，骨細胞形態完好，無嗜酸性粒細胞聚集和脂肪細胞增生（圖1A）；4周模型組：骨小梁纖細和斷裂，走形紊亂，大量骨細胞出現萎縮變小，空骨陷窩增多，骨髓腔內可見脂肪滴堆積及大量的嗜酸性粒細胞聚集（圖1B）；4周骨蝕靈膠囊組：骨小梁走形和結構改善，空骨陷窩增多，骨髓腔可見少量嗜酸性粒細胞，未見脂肪細胞增生（圖1C）；4周洛伐他汀組：骨小梁走形和結構改善，空骨陷窩增多，骨髓腔可見少量脂肪細胞增生及少量嗜酸性粒細胞（圖1D）。

表2 4周時各組兔血清TC、TG、HDL、LDL水平比較Tab.2 The levels of TC，TG，HDL，LDL in each group at 4 weeks（n=12） x ± s，mmol/L

圖1 第4周時各組股骨頭HE染色結果（×200）Fig.1 Results of HE staining of the femoral heads in the each group at fourth weeks（× 200）

2.3 MRI檢查結果 對照組：T1加權（T1WI）、T2加權（T2WI）模式顯示雙側股骨頭表面光滑，形態規則，股骨頭內部無異常信號改變，雙側髖關節間隙正常（圖2）。模型組：雙側股骨頭骺線模糊，股骨頭表面不均勻，形態欠規則，股骨頭內部出現片狀不規則的長T1短T2改變區域，T2WI提示雙側髖關節間隙增寬，關節腔內液體增多，雙側軟組織肌肉間隙液體增多（圖3）。骨蝕靈膠囊組：可見雙側股骨頭頭下無異常信號帶，關節間隙正常，腔內及周圍軟組織積液減少（圖4）。洛伐他汀組：雙側股骨頭骺線稍模糊，頭下無異常信號改變，關節間隙正常，腔內及周圍軟組織積液減少（圖5）。

圖2 對照組兔子雙側股骨頭核磁共振成像Fig.2 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the control group

3 討論

圖3 模型組兔子雙側股骨頭核磁共振成像Fig.3 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the model group

圖4 骨蝕靈組兔子雙側股骨頭核磁共振成像Fig.4 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the Gushiling Capsule group

SANFH后期造成的骨關節炎癥會對患者造成嚴重后果，甚至會導致患者喪失勞動能力，因此早期診斷股骨頭壞死并提前預防顯得非常重要［7］。臨床上股骨頭缺血壞死患者的早期發現主要靠核磁共振檢測［8］，但股骨頭內部的病理改變包括骨小梁纖細斷裂和脂肪細胞增生堆積等骨壞死變化早在MRI檢測出SANFH信號改變前就已經出現［9］，所以往往會降低早期的防治效果，影響患者的生存質量。大量研究表明激素是導致股骨頭壞死的主要原因［10-11］，而其主要是通過擾亂機體正常的脂質代謝而導致股骨頭缺血壞死［12-13］。激素可導致機體出現高脂血癥［14-15］，長期使用激素可以抑制肝脂肪酶的活性并導致機體內脂肪分解大于脂肪合成，造成大量的脂肪分解產物釋放進入血液循環，從而導致血清脂質水平增高，主要表現為TC、TG以及LDL升高以及HDL降低，使血液黏稠度增加，容易在股骨頭微循環中形成栓子，引起股骨頭微循環栓塞，造成其供血區域的股骨頭缺血壞死［16-19］。同時，骨髓基質細胞在激素的作用下向脂肪細胞分化增多，脂肪堆積等病理改變，是激素誘導股骨頭發生壞死的重要病理基礎［20］，而骨髓腔內的空間有限，脂肪堆積將引起骨內壓持續增高，股骨頭內的微小血管受到壓迫，加劇股骨頭缺血，引起股骨頭缺血壞死。臨床上發現他汀類降脂藥物可通過降低體內血清脂質水平有效預防激素誘導的股骨頭壞死亦證明這一觀點［21］。因此，在器官移植，治療系統性紅斑狼瘡，風濕性關節炎，肌無力等需要長期或過量使用糖皮質激素時［10，22-23］，盡早給予藥物干預，改善機體的脂質紊亂，防止股骨頭組織進一步的病理改變，才可以達到預防股骨頭壞死的目的。

圖5 洛伐他汀組兔子雙側股骨頭核磁共振成像Fig.5 MRI imaging of bilateral femoral heads of rabbits in the lovastatin group

國外學者研究發現，SANFH患者體內的TC、LDL水平均顯著高于正常水平，用Logistic多因素回歸分析顯示，TC和LDL是導致股骨頭壞死的獨立危險因素［15，24］。本實驗病理切片觀察到4周時模型組股骨頭組織中出現骨小梁纖細、斷裂、排列紊亂，骨髓腔內出現大量的脂肪滴堆積，在脂肪空泡間可發現豐富的嗜酸性粒細胞浸潤等股骨頭壞死病理改變。中醫學認為，本病多因患者素體腎氣虧虛，復由服用激素而發。病機關鍵為瘀血阻滯，筋骨失養，髓海瘀滯。因而其治則為活血化瘀、通絡，行氣止痛。近年來越來越多的學者通過發掘中醫藥的巨大寶藏，就中醫藥治療SANFH的相關方面進行了許多研究［12］，目前臨床將其分為氣滯血瘀型、風寒濕痹型、痰濕型、氣血虛弱型、肝腎不足型。而中藥復方骨蝕靈膠囊由丹參、白芍桃仁、紅花、川芎、土鱉蟲、自然銅、乳香、沒藥、香附、木香、牛膝等組成，具有益氣活血、補腎壯骨之功效，主要用于治療氣滯血瘀型SANFH。方以丹參、白芍為君，其中丹參活血調經，涼血消癰，安神；白芍養血調經，斂陰，緩急止痛，二藥共奏活血化瘀，斂陰止痛之功效，有研究發現，丹參素可通過降低TC含量，抑制LDL水平，及時清掃多余的膽固醇，有效調節高脂血癥大鼠血脂水平［25］。諸藥相輔相成，以活血化瘀，通絡行氣，斂陰止痛為主，兼以補肝腎，續筋接骨。正合中醫骨傷科“瘀祛”、“新生”、“骨合”的理論。本實驗通過檢測各組動物模型第2周時的血清脂質水平，發現激素均可導致TC、TG、LDL血清水平顯著升高（P＜0.01），且HDL水平顯著降低（P＜0.01）。第4周時，骨蝕靈膠囊組及洛伐他汀組與模型組相比，可顯著降低血清TC、TG、LDL水平。同期的動物模型的核磁檢測結果提示：模型組的股骨頭形態出現異常，頭下出現異常的信號改變帶，雙側髖關節間隙增寬，及關節腔內液體增多，雙側軟組織肌肉間隙液體明顯增多。骨蝕靈膠囊組和洛伐他汀組的病理切片顯示其股骨頭內部的骨小梁的結構和脂肪細胞增生肥大等組織病理情況均比模型組要改善，同期的核磁檢測結果呈相應改變，且骨蝕靈膠囊組的股骨頭組織病變程度最輕，考慮為骨蝕靈膠囊的改善股骨頭壞死作用和血脂調節能力優于洛伐他汀，具體原因有待進一步研究發現。

本實驗選取了血清脂質中TC、TG、HDL和LDL 4個脂質檢測指標研究骨蝕靈膠囊治療SAN?FH的作用，實驗結果表明上述4個血清脂質指標早期均出現代謝紊亂狀態，中藥骨蝕靈膠囊及西藥洛伐他汀可通過改善早期激素誘導的血清脂質代謝紊亂，從而達到防治股骨頭壞死的作用，且中藥復方由于整合作用強及多靶點、毒副作用小更具有優勢。本次實驗僅選取SANFH復雜的脂質代謝環節中的幾種脂質檢測指標，檢測靶點有待進一步拓展，其深入的分子機制將是下一步的研究重點。